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(無題) 削除/引用 No.6558-6 - 2018/01/07 (日) 14:01:47 - Gisuto CDさん どうもありがとうございます！自分でも勉強して、テクニシャンに指示をだしたいと思います。頑張ります！

(無題) 削除/引用 No.6558-5 - 2018/01/07 (日) 09:11:05 - CD フローサイトメーターのコアの人がdrop delayを調整しているのであれば大丈夫かなと思います。ただし一度streamが途切れた場合はもう一度drop delayをとり直す必要があります。気をつけてください。 maskはBDのAria などだとsingle cellとかpurity とか 4-wau purity とか yieldとか、そういった設定をソーティングテンプレートで設定できます。それぞれにどのような条件でdrop を捨てるかなどが決まっていますので勉強してみてください。 普通はsingletにゲートするでしょうから、いくらstickyな細胞だとしても蛍光をdetectした後に他の細胞にくっついて、結果purity を落とすというのはほぼありえないと言えるかと思います。EDTAだのCa Mgだのという話はyieldをあげるのには役立つ可能性はありますが、purityには関係ないはずです。 なのでやはりチェックすべきはdrop delay, sorting mask, sample lineだと思います。

ＣＤさん、おっとせいさん　ありがとうございます。 削除/引用 No.6558-4 - 2018/01/07 (日) 01:47:57 - Gisuto CDさん、ご教示ありがとうございます。 現在海外留学中で、日本の方からアドバイスをいただけるのは大変助かります。ＦＡＣＳ機器自体の操作は施設のテクニシャンにしてもらっており、どのような操作が行われているかまだつかめきれてないですが、drop delay はしっかり行われているようです。maskのpurityに関することですが、purityかyield重視のどちらかの選択に関してでしょうか(maskの意味が経験豊富な方にきいてもわからなかったので。すみません）。サンプルラインを洗っているかは一度確認したいと思います。うまくいかなければ一度機器を変更するのもトライしたいと思います。ありがとうございます。 おっとせいさん お返事をありがとうございます。 ソート時にはＰＢＳ+２％ＦＢＳを用いてます。前回、ＥＤＴＡは最後に細胞をリサスペンドする段階のみに加えたのですが、効果があまりなかったです。なので次は、サンプル処理の最初の段階から2mMEDTAを加えてみて再トライしてみようかと思います。DNAse処理は行っておりません。

(無題) 削除/引用 No.6558-3 - 2018/01/06 (土) 15:37:55 - おっとせい 横からすみません。 私も上皮系細胞のソーティングの系を立ち上げているところで、purityが悪いときがあり、single cell suspension作成後に細胞がdoubletを形成しやすいのが一因ではないかと思い、どのように改善しようか悩んでいるところです。 私からも皆様のご意見を伺いたいのですが、ソーティング用のBufferは皆様、どのような組成のものを用いられておられますか？ 私はソーティング後に培養を行いたいため、細胞のviabilityを高く維持したく、50%FBS入りDMEMという組成でsorting bufferを作成していますが、これでは非常に細胞が凝集しやすいのではないかと疑っています。FBSにどれほどCa/Mgが含まれているのかは分かりませんが、これにEDTAを多少加えてもほぼ無意味でしょうか？Gisutoさんはどのような組成のバッファーを使っておられますか？ また、Gisutoさん、DNase処理はされておられますでしょうか？ これもどれぐらいの反応が必要なのか私は分かりませんが、少しは効果があるのではないか、と思っています。

(無題) 削除/引用 No.6558-2 - 2018/01/06 (土) 00:57:00 - CD doubletを除去していてのことであれば、ソーター側の問題である気がします。 いずれのセルソーターを使用しているかは存じませんが、drop delayはしっかり調整されていますか？maskはpurity重視のものになっていますか？まずはそこを確認した方が良いと思います。 また、ソート後のpurity checkをソートを行なった同じマシンで解析している場合は、サンプルを流す前にしっかりサンプルラインを洗っていますか？stickyな細胞を扱う場合は血球系を解析している場合よりもしっかり洗わないとpurity checkの際にサンプルラインにくっついていた細胞を結構取り込みます。この場合はソート後のサンプルを別のサイトメーターで解析すれば、これが原因かどうかはわかるでしょう。 もう一度、経験のある人に各ステップで必要なことを確認してください。

FACSソーティングがうまくいきません（ヒト白色脂肪前駆細胞） 削除/引用 No.6558-1 - 2018/01/05 (金) 07:34:08 - Gisuto お世話になります。 今年9月からFACSをはじめました。 ヒト白色脂肪前駆細胞（セルライン）で、とある受容体に対する抗体を用いてポジティブ・ネガティブにきれいに分かれ、再現性も得られており解析自体は問題ないと思うのですが、ソーティングがうまくいきません。得られたポジ集団を再度解析したところ、ネガ集団もかなりの割合で混じりこんでいます。ネガ集団にも同じくポジ集団が混じりこみます。リソートして混じりこみの割合は若干改善しますが、劇的ではありません。 ＥＤＴＡを用いてみたり、最後リサスペンドする溶液の濃度を薄くしてみましたが（10^6cell/500ul)、あまり効果はない印象です。 ＦＡＣＳ初心者ですが、サンプル処理の手順は、ＦＡＣＳ経験豊富な方（血球系）に確認してもらっています。ただ、その方も脂肪細胞系は扱った経験がないので、自分でおきる事象が脂肪前駆細胞では一般的なのか、自分の手順などに改善すべき点があるのかわかりません。文献なども調べてみましたが、同じ組織で詳細に手順を書いているものは見つかりませんでした。どなたか経験があられましたらご教示を賜れましたら幸いです。

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