全25件 ( 21 〜 25 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.6557-5 - 2018/01/05 (金) 05:04:09 - おお 構造を解析しているものではないですし、不溶画分に大量にあっても数％の可溶画分でなんとかするぐらいで、その中にちゃんと活性があればOK程度の実験しかしてません。まあ正しいフォールディングを見極める方法論も持ってないので。なのでリフォールディングが必ずうまくいく方法があるなら今後はそれでやりたいとは思うのですが、経験はないのでこれからされるかたにアドバイスするほどのものは持ち合わせていません。 カラムでのリフォールドは代表的なプロトコールはあるでしょうけど、蛋白によってバリエーションがあるのではないでしょうか？そうだとするとやはり手探りになってしまうものなのかなとおもいます。 カラムについた状態だと蛋白が同じ場所に集中していていわば高濃度の状態になりますから、分子間でアグル可能性があると思います。なのでそういう可能性が低い蛋白や、そういう問題がうまく回避できる方法論がある蛋白において使える方法なのかなと思えます。もちろん大過剰のゲルにバッチで吸着させるとそういうアグリゲーションが起きにくくはなると思いますけど。 透析においても上記とにた問題があります（カラムほど分子間の距離が近くはないのかもしれませんけど）。 分子間でアグル可能性を回避するために一瞬にして希釈してしまう方法がありますがこれは尿素よりグアニジンなどを使ったときによくやるんじゃなかったかなと（逆だったらごめん）。

(無題) 削除/引用 No.6557-4 - 2018/01/04 (木) 17:35:32 - あかね どうせ、封入体にはいっているならGSTをやめてHisタグに変更することをオススメします。 変えるなら今のうちです。

(無題) 削除/引用 No.6557-3 - 2018/01/04 (木) 09:31:23 - KY おおさん、早速コメントいただきありがとうございます！ 4M尿素まで許容範囲内なのですね。 驚きました。酵素と基質の反応ですので、尿素存在下でGSTとグルタチオンが結合するんだろうかと思いましたが、そうなのですね。一度条件を検討してみます。 ちなみにですが、おおさんはリフォールドでうまく行った経験というのはありますか？ 昨日文献を読んでいたのですが、「ほとんどの場合、変性剤を除去することで経験的に多くのタンパク質が元の構造に戻る」と書かれていました。 もし4Mでもグルタチオンセファロースに結合するのであれば、カラム内リフォールドが可能だと思います。 カラム内リフォールドが可能であれば、使う尿素の量も、時間も大幅に節約できます。 ttps://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/pure_protein/20060925refold.html 一方、希釈法や透析法が従来の方法のようですが、これらは時間がかかったり、使用する尿素の量も多いですね。どちらが第一選択と言えるでしょうか？まずはカラム内を試してみようかと思っていますが、、、。 下のトピックのトピ主さまは、カラム内リフォールドを行い、これまでに全てのタンパク質で”精製”が成功しているとありますが、”リフォールド”が成功しているとは言っていませんね。リフォールドでうまくいった経験がないので（透析法）、ドツボにはまる危険性はあるなと感じています。おおさんのリフォールドの印象をお聞かせくださると幸甚です。また、ドツボにはまるリスクを避けるため、可溶性に増やす工夫をもっとする、ということがありましたら、併せてご意見聞かせてくださると嬉しいです。 ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=6476 質問に質問を重ねて誠に恐縮ですが、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6557-2 - 2018/01/04 (木) 09:06:11 - おお N-lauroylsarcosinateで可溶化しているのもあるけどね。 http://jvi.asm.org/content/69/5/3098.full.pdf+html - If the GST - tagged protein is not soluble under the recommended native buffer conditions (PBS - L) and is mostly or completely in the insoluble fraction, or if it does not bind to the Glutathione Affinity matrix, you may try to destabilize conformati on of the GST - tagged protein by adding the denaturant urea. Up to 4M urea has been successfully applied in the lysis and binding step and is, in principle, compatible with GST binding to immobilized glutathione. The concentration of urea or other reagents that is compatible with the target fusion protein may vary and must be determined empirically since the activity or structure of the protein might be affected by the inclusion of chaotropes or detergents. https://cube-biotech.com/files/protocols/GST_E_coli_lysate_preparation.pdf

大腸菌でのタンパク質発現（封入体） 削除/引用 No.6557-1 - 2018/01/04 (木) 02:47:25 - KY 頻出のトピックだと思いますが、求めている回答を過去トピックでは見つけられなかったので立てさせていただきました。大変初歩的な質問で恐縮しておりますが、どうぞ宜しくお願いいたします。 人生で2度目の大腸菌でのタンパク質発現に取り掛かっています。 タンパク質は哺乳動物の受容体ですが、細胞外ドメインだけをGST融合タンパク質として作製しようとしています。 1mlのBL21（OD600＝0.7）を20度、3時間、IPTG 500 microMで誘導させましたが、全てが1％トリトンX100+超音波処理で可溶化されない分画に出てしまいまして、封入体からの精製にとりかかるしかなさそうです。もしそれでも駄目なら昆虫細胞か哺乳動物でのタンパク質発現系に切り替える予定です。 早速質問なのですが、封入体からGSTタンパク質を精製する際、6M尿素で溶かした場合、その濃度を下げないとグルタチオンビーズに結合しないと思うのですが、GEのサイトや過去トピックを見ても、このアフィニティ精製時の尿素の許容濃度が書いておらず、どのようにして変性したGSTタンパク質を精製するのか考えています。過去トピックには1-2M尿素ではグルタチオンセファロースに結合するようになるかもしれない、という書き込みは見つけました。 お聞きしたいのは、尿素で封入体を溶かして、目的のタンパク質を可溶化したのちに、 1.　尿素許容濃度以下に希釈してからグルタチオンビーズで精製してから、リフォールドするのか、 2.　夾雑物存在下でリフォールドしてから、グルタチオンビーズで精製をするのか どちらが一般的でしょうか？1のような気がしますが、その際の希釈は、透析で行うべきなのか、それともこの希釈の目的にはリフォールドを含めず、単に尿素を希釈することが目的なので、もう10倍程度に一気に希釈してもいいのでしょうか？ これまでに、誘導温度を20、25、30度で行いました。20度でも十分不溶性画分に発現していましたが可溶性画分には出て来ませんでした。 また、IPTGを1000、500、250、125、62.5microMで条件検討しましたが、いずれも可溶性には出て来ませんでした。 GSTのみを発現させたものでは、同じ可溶化プロトコルでほぼ100％可溶性画分にGSTが検出されることから、大腸菌の破砕はうまく行っていると思います。 もし可溶性に発現させる工夫として、こういったものがあるよ、というコメントをいただけましたら嬉しいです。また、封入体から変性剤で可溶化したGSTタンパク質を精製する方法としてご提案がありましたらご教示いただけますと幸甚です。 新年早々誠に恐縮ではありますが、宜しくお願いいたします。

全25件 ( 21 〜 25 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---