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(無題) 削除/引用 No.6551-7 - 2017/12/29 (金) 15:22:56 - ぁswでfrgtぃkp；＠：「 1.について Flag-tag affinity beadsによる精製ではないですが、細胞ライゼートの遠心は12000xg、４C、10minでも非特異的な蛋白質の持ち込みはほとんどないです。 対象蛋白質がよりマイルドな（組成のシンプルな）lysis bufferでも可溶化できるならば、その方が最初の段階で細胞骨格系などの余計な蛋白質を除けて、界面活性剤で中途半端に可溶化したものなどに由来する非特異的なものも減るのでそういったことも検討の価値あります。lysis bufferを緩いのから強いのまで変えて段階的に抽出し上清と沈殿をウェスタンで分析し、対象の蛋白質がどの画分にくるかチェックします。 なおビーズの遠心による洗浄は、非特異的な蛋白質の混入を増す主原因の一つなので、磁気ビーズの使用を強く勧めます。 2について 経験的な印象ですが、２回あらっても除去できないものは、たぶんそれ以上洗っても残ります。界面活性剤によるwashingはみなさん勧めますが、わたくしはあまりありがたみを感じた事無いです。washingの時にwashing bufferの濃度を塩濃度を少し上げる（例、0.5M NaCl)と非特異的なものが予想外に減ったたことがあります。抗原抗体複合体はこの程度のhypertonic bufferではまずはずれません。なので１回はそうしたbufferで洗うようにしています。非特異的吸着の背景には意外と電気的なインターラクションがあるようなきがしています。 3について 回収率よくなかったです。

(無題) 削除/引用 No.6551-6 - 2017/12/29 (金) 12:52:15 - TS 0.5-1％TritonはFアクチンを沈殿、分離するのに使われますよね。 超音波なんかで細片化すれば、少なくとも大部分浮いている感じにはあるとは思いますが、完全には難しいと思います。 プレクリアをすれば遠心も入るし、１も含まれると思うので良いかもしれません。 ただアクチンとの相互作用を見たいときに、不溶化してしまっているからと言って、遠心で除いてしまうのは、実験の目的に合いますか。 それでも見たいものがきれいに見えれば、大丈夫かもしれませんが。 マグネットビーズは良い案と思います。遠心沈殿によるコンタミがなくなりますから。 アクチンを可溶する中性界面活性剤でCO−IP向きのものはちょっとわかりません。超音波とマグネットビーズを組み合わせれば、でかなり解消しそうですが。 WBにはSDSが使えるんですけどね。。。CO-IPとなると。。。

(無題) 削除/引用 No.6551-5 - 2017/12/29 (金) 12:42:50 - おお 3000g、5分は弱いと私も思います。マイクロチューブ用遠心機なら最高回転でやるといいかと。プレクリアも加えるといいかと思います。オーバーナイトより数時間で一日で終わらせたほうがバックも減る可能性があるんじゃないかと。 あとはバッファーはRIPAなどはバックグランドが低いです。 重合したアクチンについているなら、それを回収してからという手は取れないかなぁ、、、

(無題) 削除/引用 No.6551-4 - 2017/12/29 (金) 11:01:42 - アクチン TS様、早速ありがとうございます。 １％トリトンX100では可溶化できないですか、、、。 やはりプレクリアは追加すべきですね。たぶんですが、1でだいぶ解決するんじゃないかと期待はしているのですが、調べるとCO-IPではアクチンが曲者と書かれてあるサイトがいくつかありましたので、ビーズのブロッキングもした方がいいのでは？とも考えています。 あとはマグネティックビーズか、、、。 アクチンの可溶化には一般にどんな界面活性剤が使われるんでしょうか？ SDSは共沈降せねばならないので、使えません、、、。

(無題) 削除/引用 No.6551-3 - 2017/12/29 (金) 10:05:54 - TS 追加で。1％Tritonでは重合しているアクチンを完全に可溶化はできないと思います。

(無題) 削除/引用 No.6551-2 - 2017/12/29 (金) 10:04:17 - TS １−３はどれも可能性があると思いますけど、 一般的なファーストチョイスはプレクリアかもしれません。

免疫沈降時の非特異的吸着について。 削除/引用 No.6551-1 - 2017/12/29 (金) 09:55:31 - アクチン お世話になります。 今、293T細胞にFLAG付きタンパク質を過剰発現させ、抗FLAG抗体で免疫沈降した時のアクチンの共沈降を見ていますが、FLAGを発現していないベクターコントロールの293T細胞でもアクチンが共沈降してきてしまいました。 おそらく不溶性のアクチンが遠心時にビーズと一緒に落ちて来ているか、あるいはビーズへの非特異的な吸着だと思われます。 293T細胞は6ウェルでプレートし、リポフェクション後48時間で細胞を回収し、1％トリトンX100を含む溶解バッファー400マイクロLで可溶化し、3000g、5分遠心した上清を免疫沈降に用いています。 オーバーナイトで免疫沈降後、プロテインGビーズを加え、一時間さらに4度でローテート後、2000g、2分で遠心し、ビーズを冷PBSで2度洗浄しています。その後はSDSサンプルバッファーとボイルで溶出し、ウエスタンブロットにてアクチンやFLAGを見ています。免疫沈降の効率はよいです。 今考えていることとして、 1.　溶解バッファーで可溶化後、細胞を3000g、5分ではなく、20000g、5分で遠心した上清を免疫沈降に用てみる 2.　ビーズの洗浄は冷PBSで2度洗浄とはいわず、1％トリトンX100の入った冷PBSで3度洗浄してみる 3.　FLAGペプチドで溶出してみる くらいしか思いつきません。共沈降でアクチンを見たのはこれが初めてで、こういう非特異的な沈降はアクチンでは起きやすいのかどうかがとても気になる点です。 大変初歩的な内容かと思いますが、ご教示いただけますと幸いに存じます。

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