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(無題) 削除/引用 No.6538-9 - 2017/12/26 (火) 13:24:11 - hansen 皆様様々な御意見、大変ありがとうございます。 Bradfordへの違和感は確かにあるので、BCA法などへの変更が良いと今のところ考えています。 最近はThermoのPierceキットなど、従来法の良いとこ取りのような方法もあるようで、業者にも評判の良いキットを聞いています。

(無題) 削除/引用 No.6538-8 - 2017/12/23 (土) 11:14:06 - 小児科医師（ゆとり教育） うちの研究室でもBradford法で蛋白濃度を測定していましたが、Bradford法だとloading controlがブレることが多かったです。そこで、BCA法に変えたところ、loading controlがキレイにそろうようになりました。 その原因として、たんぱく質抽出液にはdetergentであるsodium deoxycholateやSDSが含まれており、それらの影響がBradford法では強く出ることによると考えられました。たんぱく質抽出液を十分に希釈し、Bradford法の添付文書が指示する濃度までdetergent濃度を下げても、蛋白濃度がブレる原因となっていました。 Which Protein Assay Camp Are You In? Bradford vs BCA https://advansta.com/bradford-vs-bca-protein-assay-camp/ A lot of people like the Bradford assay because fewer substances interfere with the assay (including reducing agents) – with the notable exception of high concentrations of some detergents. Which can be a problem if you require a lot of detergent to lyse your cells. 以上のサイトでも言及されていますが、このような場合はBCA法を使うのがよさそうです。

(無題) 削除/引用 No.6538-7 - 2017/12/23 (土) 05:23:05 - あqwせdrftghyじゅmkl ローディングコントロールと言われる蛋白質の量が一定にそろうはず、ということの科学的根拠はないとおもう。てかローディングコントロールという名前自体どうよと思います。

GE　total Protein Normalization 削除/引用 No.6538-6 - 2017/12/22 (金) 21:17:15 - ema トレンドといえば、GEは最近タンパクのノーマライズを2色の蛍光色素にして「total Protein Normalization」を勧めています。 https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/42623.html

(無題) 削除/引用 No.6538-5 - 2017/12/22 (金) 16:22:15 - おお ＞また、総タンパク質系のデータは場所を取るので、 ぽんぞーでも非常に強い発現をする蛋白がある部分だけ示すというのはあり得えます。Histonとかならぽんぞーでもくっきり見えるんじゃないかな。動物で筋肉ならMyosin heavy chainの部分のCBBやぽんぞー染色によるバンドをインターナルコントロールとして置くことがよくあります。

(無題) 削除/引用 No.6538-4 - 2017/12/22 (金) 16:11:54 - おお >同ロットの検体群でも別の日に泳動するとバンドの強弱がブレること Sample bufferで保存したものを違う日にやったということでしょうか？その違う日にやったというのは前にやったのより強いとか弱いとかどのように判断したのでしょうか？傾向として弱くなるとか強くなるとかあるのでしょうか？ ぽんゾー染色はそれでデーターにするとか言う前に、タンパク量が実際にどうなっているかなど情報量ふえるので確認はすると良いと思います。たぶんそういう趣旨で書いてくれたのではと・ 酵母はとくにプロテアーゼ活性が強いのでサンプルの取扱が難しいかもしれませんが、実際どのようにLysateを得ているのでしょうか？ ボイルなどでアグリやすい蛋白もありますけど、そういうのが影響している可能性はないでしょうか？ >タンパク質量を合わせてloading controlの結果をきれいにするコツ タンパク量の変動がない蛋白を選べば普通揃うものだと思いますので、どう答えていいのか、、、

(無題) 削除/引用 No.6538-3 - 2017/12/22 (金) 15:15:14 - hansen ありがとうございます。 私もポンソーやCBBの方がタンパク質全体を観察できてデータとして上位だと思うのですが、論文のトレンドがone control proteinであり、また、総タンパク質系のデータは場所を取るので、難もあるかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.6538-2 - 2017/12/22 (金) 15:00:14 - まっくろん 　特定のタンパク質ではなく，メンブレン全体をポンソーかなんかで染めてはいかがでしょうか？

western blottingにおけるタンパク質量の誤差 削除/引用 No.6538-1 - 2017/12/22 (金) 14:20:56 - hansen 酵母のタンパク質抽出液をwestern解析する時に、loading controlとしてPgk1を用いていますが、タンパク質濃度をBradford法で測定してタンパク質量を合わせているにも関わらず、Pgk1のバンドがあまり揃わないことがあります。 特徴的なのは、同ロットの検体群でも別の日に泳動するとバンドの強弱がブレることで、むしろ本来の目的タンパク質の解析の方が再現性が良いこともあります。 Bradfordやwesternのloading controlの正確さに限界があることは常識だと思いますが、論文によってはloading controlがかなりきれいで羨ましく思います。 これは酵母の系とかPgk1に限ったことではなく、western全般の問題だと思いますが、タンパク質量を合わせてloading controlの結果をきれいにするコツがあったら教えて頂けるようお願いします。

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