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(無題) 削除/引用 No.6533-13 - 2018/01/28 (日) 18:15:35 - おお >少なくともそのcDNAクローンからは機能欠失型のタンパク質ができる 攻撃しようと思っているわけではないけど、削れた部分が見ようとしている機能に関係ない部分であれば、配列が一部かけていたからと言って機能がないタンパク質とは言えないのでは？ またそのRNAから蛋白が発現していると言い切る根拠があるかというと、RNAがあるからそこから蛋白が合成されているかもしれないという推測でしかないように聞こえますが。

(無題) 削除/引用 No.6533-12 - 2018/01/27 (土) 15:48:46 - のま > cDNAでもストップコドンが生成するフレームシフト変異が入っていれば、これは蛋白がノックアウトされていると考えてよいのでしょうか？ すべてフォローしているわけではありませんが、少なくともそのcDNAクローンからは機能欠失型のタンパク質ができるということでいいと思いますが、ただ他にspliced variantがあるような場合は慎重に判断する必要がありそうです。 cDNAをプラスミドにクローニングして、ここのRNAクローンをsequencingはされたのでしょうか？ つまり、例えば20個ほどの大腸菌コロニーからminiprepして、そのsequencingをされたのかどうか気になります。20個すべてでp.G21Ifs*52を持っているのか、それとも19個がp.G21Ifs*52を持っていて、残り1つは機能的に正常なタンパク質を作るalternative spliced mRNAができている可能性もあるかと思います。（現に私の場合そうでした）

(無題) 削除/引用 No.6533-11 - 2018/01/27 (土) 14:51:46 - AA 逆転写の際のプライマーはOligdTをお使いでしょうか？ フレームシフトが入っている場合、mRNAは分解に進む印象を持っていたのですが、 分解されずに完全長のものが残っているとしたら、 定形外翻訳が行われていてもおかしくないように思います。

cDNAシーケンスの結果 削除/引用 No.6533-10 - 2018/01/27 (土) 11:40:58 - 小児科医師（ゆとり教育） 以下のようにcDNAを合成し、開始コドン周辺のシーケンスを行いました。 1) 野生型、およびgenomic DNAでストップコドンが生成するフレームシフト変異を有すると判明しているマウス（p.G21Ifs*52）を使用。 2) 目的蛋白の発現が多いことがわかっている脳からTrizolでRNAを抽出。 3) SuperScript IV Reverse TranscriptaseでcDNAを合成 4) NCBIのprimer-blastで生物種でマウスを選択して設計したプライマーを使用してPCR 5) 同じプライマーを使用してサンガー法にてシーケンス 結果は、cDNAにもgenomic DNAと同じ場所にp.G21Ifs*52の変異が入っていました。ウェスタンブロットは何回か抗体を変えて繰り返しましたが、変異型マウスでバンドが消えたり、バンドの位置が変わったりすることはありませんでした。外観上、phenotypeが出ているか判別する方法はなく、採血で甲状腺ホルモンを測定すれば表現型を見ることができる可能性があります。 cDNAでもストップコドンが生成するフレームシフト変異が入っていれば、これは蛋白がノックアウトされていると考えてよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6533-9 - 2017/12/24 (日) 21:48:15 - 小児科医師（ゆとり教育） KIOさん、コメントありがとうございます。 前述しましたが、この蛋白は約600個のアミノ酸から構成され、InDel変異により22-25番目のアミノ酸に変異が起こり、そこから50番目くらいのところでストップコドンが生成されています。使用した抗体は180-229番目のアミノ酸をターゲットとしており、定型外翻訳で蛋白が作られているとするとこの抗体で検出されることは矛盾がない結果です。ただ、ウェスタンブロットで確認できるほどの分子量の違いは検出できませんでした。 No.6533-3で述べた2つ目の抗体は、11-274番目のアミノ酸をターゲットとしており、ヒトに反応性があり、ウシがpredictとなっていました。マウスはSpecies reactivityには記載がなかったのですが、ウェスタンブロットを行ったところやはりバンドが検出されませんでした。現在、1-71番目のアミノ酸をターゲットとする3つ目の抗体を購入手続き中です。また結果が出ましたら報告させていただきます。

N末端領域に対する抗体 削除/引用 No.6533-8 - 2017/12/24 (日) 15:44:11 - KIO 定型外翻訳ならN末端側が欠損しているはずです。 N末端側を認識する抗体ではタンパク発現を認めず C末端側を認識する抗体でタンパク発現を認めるはずでは？。

(無題) 削除/引用 No.6533-7 - 2017/12/21 (木) 17:11:26 - AA ゲノム編集で日常的に組み換えマウスを作っていますが、 NHEJで作成したKOがKOにならない、というケースはやはり頻発しています。 1st ATGを標的にしたfloxマウスでも同じように欠損しなかったこともあるので おそらく定形外翻訳は結構高頻度で起きているんだと思います。 なので現在我々は基本的に数エクソンまとめて欠損させる形でKOを作成するようにしています。 (ルーチンのジェノタイピングが楽になるという副効果もあります) 定形外翻訳を証明するというのは難しいですね。 ゲノム配列に対して、タンパク質が検出されている事自体が証明になるのではないでしょうか？ そもそも野生型の配列に対しても定形外翻訳がされていない、という証拠もないと思います

(無題) 削除/引用 No.6533-6 - 2017/12/21 (木) 15:26:25 - 小児科医師（ゆとり教育） おおさん、コメントありがとうございます。 スキップしたり、フレームシフトしたりすると蛋白の分子量がずれることもあると思うのですが、今のところ、ウェスタンブロットでは分子量のずれは確認できていません。mRNAの発現状況を先に確認して、どのような蛋白が作られて抗体が反応しているのかをみていこうと思います。 ホモマウスはgenomic DNAを抽出し、PCRにて増幅後、シークエンスをして配列を確認し、目的の遺伝子にストップコドンを生成する変異がhomozygousで入っていることを確認しています。 この蛋白はOATPファミリーに属するので、似た遺伝子というのはありうると思います。ただ、目的蛋白に特異的な抗体が、目的蛋白ではなく似た遺伝子から翻訳された蛋白を検出しているとするとかなりお手上げな状況です。

(無題) 削除/引用 No.6533-5 - 2017/12/21 (木) 11:22:05 - おお ゲノムに非常に似た遺伝子が存在するとか

(無題) 削除/引用 No.6533-4 - 2017/12/21 (木) 10:29:29 - おお スプライシングにより従来Stopになるところがスキップしたり、フレームシフトしたりすることもあるかもしれませんね。ホモのそのマウス、ゲノムは確認しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6533-3 - 2017/12/21 (木) 09:35:30 - 小児科医師（ゆとり教育） おーばーれいさん、コメントありがとうございます。 抗体の特異性に問題がある可能性は疑っており、現在、ほかの種類の抗体を使ってウェスタンブロットを行っています。今日、二次抗体をつけて撮影する予定なので結果を報告します。 50-55ntルールについては詳しくないのですが、目的の蛋白は約600個のアミノ酸から構成され、InDel変異により22-25番目のアミノ酸に変異が起こり、そこから50番目くらいのところでストップコドンが生成されています。このような場合、truncated proteinとして翻訳されてしまう可能性はあるでしょうか？ mRNAの発現はまだ確認していないのでこれから確認します。確認の方法は、TrizolでRNA抽出→逆転写にてcDNAを合成→realtime PCRの手順でよかったでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6533-2 - 2017/12/21 (木) 01:53:39 - おーばーれい 抗体の特異性をまずは疑ってしまいますが、そのマウスでは表現型は出ているのでしょうか。 トランケートのものができていることはありませんか？50-55ntルールで。 mRNA発現レベルはどうなんでしょうか。

Crispr/Cas9で作製したノックアウトマウスで、蛋白が消えない 削除/引用 No.6533-1 - 2017/12/20 (水) 23:59:20 - 小児科医師（ゆとり教育） いつもお世話になっております。 CRISPR/Cas9で、ある蛋白のノックアウトマウスを作製しました。ストップコドンを生成するフレームシフト変異が入った数系統のマウスを得ました。交配によりそれらのホモマウスを作製し、そのうちの2系統をウェスタンブロットで解析しました。しかし、目的の蛋白がノックアウトされていませんでした。 抗体はAbcamから購入した目的の蛋白に特異的な抗体ですが、異なるフレームシフト変異を持つ2系統のいずれも野生型と同じ濃さの蛋白が発現していました。蛋白のバンドはシングルバンドで予想された位置にあるため特異的に蛋白が検出されていると考えています。そこで質問なのですが、 １）この現象を説明できる可能性として、定型外翻訳という現象があることを知りました。この現象は、異なるフレームシフト変異に対し、どちらにも起こるということはあり得るのでしょうか？また、理研のHPにも「定型外翻訳は様々な生物で一般的に起こりうる現象である」と記載されているように、頻度として結構起こる現象なのでしょうか？ 理研　ゲノム編集の落とし穴（すみません、URLを貼ると投稿できませんでした） ２）もし、定型外翻訳が起こっているとして、それを証明する方法としてどのようなものがあるでしょうか？今のところ考えているのは、mRNAを抽出してcDNAを合成しシークエンスを行うというものなのですが、それで定型外翻訳が起こっている証明になるのか分かりません。 お手数おかけしますが、上記につきましてご教授賜りますと幸いです。

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