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(無題) 削除/引用 No.6526-5 - 2017/12/15 (金) 12:26:27 - rice ありがとうございます。 試します。

(無題) 削除/引用 No.6526-4 - 2017/12/15 (金) 11:57:24 - AP 50xTAEを1/50 vol入れとくのが簡単です。

(無題) 削除/引用 No.6526-3 - 2017/12/15 (金) 11:16:09 - rice >AP様 ご指摘ありがとうございます。 DyeはTOYOBO社の6xのものを使用してます。 泳動サンプルですが、96wellを用いて予めDye:ミドリ＝2:1uLで調整したものを分注してPCR産物を8uL加えて泳動しています。 素人質問で申し訳ないのですが、 バッファーするというのは、DyeをTAE等で希釈しておけば大丈夫でしょうか？pHの偏りにもよると思いますが、希釈の目安をご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6526-2 - 2017/12/15 (金) 08:29:44 - AP 泳動サンプルの調製方法は？ ローディングダイはどういうのを使って、どういう割合で混ぜてる？ 普通のローディングダイはバッファーされていないので、かなりpHが偏っていたりする。使い方によってはDNAの変性やチャージの変化が起こり移動パターンがおかしくなる。 ローディングダイをあらかじめTAEやTEでバッファーしておくと安心。

PCRでバンドが2つ現れる 削除/引用 No.6526-1 - 2017/12/15 (金) 01:30:43 - rice 学部生です。 卒業研究でPCRを行っていますが、以前までバシッと一本で出ていたバンドが2本になる現象に遭遇し当惑しています。 現在、ベクターを鋳型に、インサートした配列をT7、SP6プロモーターのプライマーで増幅させています。 ・インサート配列はMCS含め600bp前後 ・ポジコンはすでにT7-SP6で増幅させたDNA ・PCRはGo taq、検出はアガロースゲルとミドリグリーンを使用 1ヶ月前までは1つのバンドが得られていましたが、 最近になり、目的のバンドの100bp下にもう一つ薄いバンドが出るようになりました。インサート配列の異なる４サンプルで同様です。 泳動した後のゲルをエチブロで再染色して観察しましたがそちらも2つのバンドでした。 また、アニーリング温度を60℃から65℃に挙げてみましたが、サンプルはPCRがかからずポジコンは2つのままでした。 試薬を変えても変化ありません。 原因が分かる方いましたらよろしくお願いいたします。

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