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(無題) 削除/引用 No.6522-13 - 2017/12/17 (日) 16:29:05 - １２３ 皆様にコメントをいただき、当面の方針が自分の中で得られた気がします。 また、レンチウイルスに慣れた方々からのtipsの様なものも大変参考になりました。これで一旦トピックを解決とさせていただきます。 場合によってはまたご相談させていただくかもしれませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6522-12 - 2017/12/17 (日) 16:26:09 - １２３ Xさん タイトレーションの方法をお教えいただきありがとうございます。 仰るように実験毎にMOIが変化することによって、感染効率やインテグレートされるコピー数が変わり表現形の出方に違いが出てるのも嫌ですね。 まずは小ロットでウイルス作成、感染させる実験を何回か繰り返し、感染効率や表現形がどれほどのものか検討してみたいと思います。 その上で、必要であればタイトレーションや濃縮によるストック作成も考慮したいと思います（濃縮も超遠心機を借りれば可能ではあるのですが、若干制約があるのでー）。

(無題) 削除/引用 No.6522-11 - 2017/12/16 (土) 20:39:03 - X タイトレーションは、線維芽細胞系の付着細胞（NIH3T3など）を使って、ウイルス溶液の希釈系列での感染率（通常は蛍光マーカーの入ったウイルスを用いているので、FACSで測定）と、感染時の細胞数から算定しています。標的の細胞も付着細胞であれば、MOIをそんなに上げなくても入ると思いますが、感染効率を１００％に近づけたい場合は、それなりの量のウイルスが必要になるかもしれません。レンチウイルスの場合、MOIを上げて感染効率を１００％に近づけると、マルチコピーでゲノムにインテグレートされた細胞が増えてくるので、細胞ごとに感染したウイルスのコピー数をある程度そろえたい時（導入遺伝子量によって表現形が変わる可能性がある場合など）は、７０−８０％くらいの感染効率に抑えた方が良い場合もあり得ます。この辺りも考慮の上、濃縮するかどうか決めると良いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6522-10 - 2017/12/15 (金) 11:12:40 - １２３ MPさん ありがとうございます。いくつかのプロトコールを見ましたが、MPさんの様に翌日にメディウム交換、というのが多いですね。感染効率と細胞の元気さ？を見て、判断してみたいと思います。 おおさん ありがとうございます。10cm dishでのプラクティカルなウイルスの回収の仕方、ちょうど私の系に良さそうなボリュームですし、単純に細胞を飼い続けるよりはタイターも良いのではないかと思いますので、是非参考にさせていただきたいと思います。 Xさん ありがとうございます。 付着細胞ですが、文献上は感染効率はさほど悪くはない（系にもよるとは思いますが、せめて3−4割程度はある）と思っています。 やはり一度試してみないと何とも言えないところはありますが、感染時間を短くしたり、凍結融解もオプションとしてありうる、というご意見、大変参考になりました。 レンチウイルスのタイター測定はどのように行われておられますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6522-9 - 2017/12/15 (金) 07:10:37 - X 自分の場合は、タイターを測定した後、MOIを合わせてウイルス感染実験を行なっているので、凍結保存は避けられません。タイターがあまり出ない、あるいはその初代培養細胞が浮遊細胞などで感染効率が低い場合は、濃縮します。よって、お示しの中では一番目の方法を取ると思います。15cmプレートで問題ないと思いますが、扱いに慣れてなければ、10cmで枚数を増やしても変わりないと思います。凍結融解によるタイターの低下はそれほど問題になる感じはしませんが、タイター自体と感染標的細胞の細胞腫は大切と思います。感染時間は、６ー８時間くらいでも大丈夫と思いますが、これも標的細胞の種類によると思います。 ウイルス感染後、遺伝子導入細胞を選択する（薬剤選択あるいは蛍光マーカーであればソート）予定であれば、感染効率が悪くてもある程度対応可能なので、濃縮なしでやっても良いと思います。もちろん、濃縮なしで高タイターのウイルスが取れ、標的細胞への感染効率も良いようなら、濃縮は不要です。

(無題) 削除/引用 No.6522-8 - 2017/12/14 (木) 18:59:08 - おお >15cm dishより10cm dishの方が、細胞あたりの培地の量が多い、 ああ、確かに面積あたりは2乗体積は３乗になるので増えるかと、、、高さが同じでもいいので面積あたり直線的な関係でもいいわけですね。。。 えっとプラクティカルには１０cmDishなら５mlの培地で導入してます。で毎日４mlずつ回収し、合計１２mlを合わせて使ってます（よほどタイターのいくらかの違いでで実験が左右されるのでなければそれぞれからタイターの高いものを選ばなくても十分とおもって）。 １５cmDishならそのわりあいだと１５mLだけどこれはきついと思う。

(無題) 削除/引用 No.6522-7 - 2017/12/14 (木) 13:31:47 - MP 私はいつも24hでmediumを交換しています。もっと短くてもいいかもしれませんが、それも感染効率によりけりだと思います。

(無題) 削除/引用 No.6522-6 - 2017/12/13 (水) 15:28:13 - １２３ MPさん ありがとうございます。 濃縮なしの系がワークするのであれば私もそちらの方が楽だと思っているので、今回の質問の回答をふまえた上で一度は試してみようと思っています。 293Tによるメディウムの劣化は私も少し懸念しているのですが、レンチウイルスを含むメディウムを対象細胞に添加する時間は最低どれぐらいは確保するべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6522-5 - 2017/12/13 (水) 14:49:05 - MP どのような細胞なのかわかりませんが、作成したレンチウイルスがどの程度感染するかによっても変わってくる。濃縮なしで十分な感染効率を示せば、それが一番簡単だし、タイターも凍結融解を繰り返さなければそれほど落ちない。ただ感染時にウイルスを作ったときの培地、それもかなりovergrowthしたものを細胞にかけることになるので、その影響を避けたいのであれば超遠心で濃縮すべき。

(無題) 削除/引用 No.6522-4 - 2017/12/13 (水) 14:21:09 - １２３ おお様 早速ありがとうございます。 大事なこととしてわざわざ2回御指摘いただいたところ大変恐縮なのですが、15cm dishより10cm dishの方が、細胞あたりの培地の量が多い、というのはどうしてそのようになるのでしょうか？ 10cm dishの面積は55cm2、15cm dishの面積は152cm2で、細胞数も面積比に応じて１：３ぐらいだと思います。 一方、メディウムの量については、個人的には10cm dishでは通常10ml、15cm dishでは20mlぐらいで細胞をかっているのですが、これではむしろ10cm dishの方が細胞あたりの培地の量が多くなる気がします。間違っていますでしょうか？ （頓珍漢なことを言っていましたら申し訳ございません）

(無題) 削除/引用 No.6522-3 - 2017/12/13 (水) 09:50:26 - おお 大事なことなので二回言います。

(無題) 削除/引用 No.6522-2 - 2017/12/13 (水) 09:33:21 - おお 15cm dishでやると、Dishにのっている細胞あたりの培地の量が多くならないか？ということは培地をそのまま使うのであれば１０cmでやるほうがタイターがたかくなる。 15cm dishでやると、Dishにのっている細胞あたりの培地の量が多くならないか？ということは培地をそのまま使うのであれば１０cmでやるほうがタイターがたかくなる。 超遠心は濃縮できるのでどのスケールでやるにしろあとあと使いやすいだろうけど、 BSL-2でしかも無菌というのが結構面倒かなと思うのですが。かえってリスクが大きくなりそうだし。

レンチウイルス感染について 削除/引用 No.6522-1 - 2017/12/13 (水) 09:20:48 - １２３ いつも勉強させていただいております。 レンチウイルスを用いてマウス初代培養細胞に遺伝子導入する実験を予定しています。 ある特定の細胞集団をソートした上で遺伝導入を行うため、１回の実験で遺伝子導入をする細胞量はさほど多くなく（最大で6well dishに3well程度）、レンチウイルスの産生・保存をどのように行うのが良いか参考にさせていただきたく、投稿いたしました。 現在考えている方法としては、 １．大きめのスケール（15cm dishや大きなフラスコ複数枚）でレンチウイルスを作成し、超遠心により濃縮、分注の上−８０℃保存して、必要な分のみその都度融解し使用する。 ２．15cm dish１枚のみでレンチウイルスを作成し、そのメディウムを濃縮せずそのまま導入する細胞に添加する。余ったメディウムは濃縮せず、そのまま分注し−８０℃保存。 ３．さらに小さいスケールで、１回の実験で使うと思われる量のレンチウイルスを作成し、そのメディウムをそのまま導入細胞に添加。ウイルス含有メディウムはその都度使い切る。 の３つを考えており、それぞれ一長一短があるのではないかと思っています。 （作成の手間を考えると、前者ほど楽ですし、凍結融解に伴うタイターの低下の面では後者が勝るのではないかと思います） ちょうど間を取った２がベストかも、とも思っているのですが、ウイルスを濃縮せずに-80℃保存するのはタイターが落ちやすい、などの不都合があったりしますでしょうか？ また、レンチウイルスに慣れておられる方でしたら、このような場合、どの方法を取られますでしょうか？ ご意見をいただけましたら幸いです。宜しくお願い致します。

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