BioTechnicalフォーラム [Ni Sepharose 6 Fast Flowのノンスペについて]

Ni Sepharose 6 Fast Flowのノンスペについて

No.6520-TOPIC - 2017/12/13 (水) 06:11:10 - Ni Sepharose 6 Fast Flow

お世話になります。

293T細胞にヒスタグタンパク質（細胞質局在の可溶性タンパク質）を一過性に過剰発現させ、セルライセートを調製後、Ni Sepharose 6 Fast Flowと混和し、4度で4時間インキュベートしました。

その後、PBSでビーズを数回洗浄したのち、SDSサンプルバッファーで溶出し、SDSPAGEしたところ、過剰発現させていないネガコンでさえも、ポンソー染色で低分子から高分子までがっつりと染まってしまいました。

もちろん細胞内に多くのポリヒスチジンタンパク質があることは知っていますし、洗浄も少量のイミダゾールを含むもので洗うべきだと思います。また溶出もSDSサンプルバッファーでなく、高濃度イミダゾールですべきです。次回、検討予定です。

それ以外に、何かノンスペを減らす工夫などありますでしょうか？

よろしければご教示くださいますと幸いです。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全8件 ( 1 ～ 8 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.6520-8 - 2017/12/13 (水) 14:14:29 - おお

>SDSサンプルバッファーで溶出しますか？

SDS単独ではなんとも言えないけど、SDSがあるとビーズとの相互作用が阻害されるので吸着させるときはつかいません。メルカプトエタノールが高濃度入っているのも手伝って、サンプルバッファーはNiビーズから蛋白を溶出させるのに十分な作用があると思います。

(無題)

削除/引用

No.6520-7 - 2017/12/13 (水) 14:02:21 - み

哺乳類細胞での発現蛋白精製にHis-tagを使用すること自体に問題を感じる。
His-tagじゃないといけない理由があるなら仕方ないけど。

極力、目的蛋白が含まれるフラクションを分取して、樹脂と反応させる時から低濃度のimidazoleを添加しておいて、溶出も皆さんが書かれているようなEDTAかimidazoleで競合させた方が良いでしょうね。
でもコントロール細胞でもがっつり吸着してきている現状をみると最初の疑問に行き着く。

(無題)

削除/引用

No.6520-6 - 2017/12/13 (水) 13:36:30 - qq

＞PBSでビーズを数回洗浄したのち、SDSサンプルバッファーで溶出し、
そもそも、His-tagタンパク質はSDSサンプルバッファーで溶出しますか？
NiにSDSが吸着して、His-tagタンパク質が溶出するかもしれませんが、ちょっと不安な感じです。EDTAかImidazoleで溶出するほうが良いんじゃない？

(無題)

削除/引用

No.6520-5 - 2017/12/13 (水) 07:14:02 - おお

イミダゾール溶出もステップワイズで溶出して、物があるフラクションを集めると親和性の違いである程度振り分けられるかもしれません。
５０、１００、２００、３００、４００、５００mMとか

(無題)

削除/引用

No.6520-4 - 2017/12/13 (水) 07:09:28 - おお

あと漠然と想像するに、高いpHで抽出すると塩基性の強いものは溶出されにくくなる傾向があるので、もしかしたらNiに親和性のある塩基性アミノ酸の豊富な蛋白が減るかも。

(無題)

削除/引用

No.6520-3 - 2017/12/13 (水) 07:03:52 - おお

細胞質の蛋白がエンリッチされるようにLysateを調製してますか？

Lysateにお使いのビーズと同じ材質のものを加えてプレクリアーするとましになるかもしれません。もしそういうのがないなら、Ni SepharoseをEDTAをくわえて洗って、Niを溶出させたものでもいいかもしれません。