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(無題) 削除/引用 No.6507-10 - 2017/12/06 (水) 01:10:15 - おお 皆さんのおっしゃっているようにクローニングのストラテジーがよくわからない。BamHIの間違えかもしれないけどその場合はフレームが合わないといけないとか理由があるのかもですが、、、 各スッテップコントロールをとればどこに問題があるかわかることも多いと思います。CIAPが聞いてないと思うならCIAP処理なしと比べればいいわけだし。

(無題) 削除/引用 No.6507-9 - 2017/12/05 (火) 20:26:55 - mon ちなみにCIAPやSAPは制限酵素と同時に添加しても良いです。

(無題) 削除/引用 No.6507-8 - 2017/12/05 (火) 19:42:13 - AP 補足しますと、 CIAPってじつはかなりよく効く酵素です。ちゃんと制限酵素で切れていればCIAP処理をしたあとにself-ligationはまず起こりません。 それでも空のプラスミド（いわゆる"self-ligation"）のコロニーが出るのは、部分変性により制限酵素耐性になって切れずに環状のまま残っているプラスミド（"ghost band", "ghost plasmid")が原因です。 それにしても、トピ主不在でモヤモヤ感が晴れない。

(無題) 削除/引用 No.6507-7 - 2017/12/05 (火) 19:13:49 - mon cloning siteが、Bgl2-Hind3-Bgl2になっているのかな。。 どちらにしろ、制限酵素で切れないplasmid(変性環状DNA）が混入していると思います。泳動で見えないくらいでも結構なコロニー(insertなし）が出てしまいます。アルカリSDS法でアルカリ処理が長いと多くなります。 過去ログで言及されていますが、長めの電気泳動して(目的断片と変性環状DNAを分離し）切り出す、Mung Bean Nuclease処理＞PCI処理＞EtOH沈殿や、Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase処理＞heat-inactivation等を行うと 変性環状DNAによるコロニー形成を激減出来ます。

(無題) 削除/引用 No.6507-6 - 2017/12/05 (火) 18:46:48 - み >[Re:4] APさんは書きました : > >HindIIIではなくBamHIで切るんじゃない？？ > > だとしても、二重消化する意味ないと思わない？　どうせdirectional cloningにはならんのだから。 Bgl-BamHIにBgl断片を入れたあと、インサートチェック時にBglとinsert内の酵素のdouble digestをすれば当りが見つけられるかな。

(無題) 削除/引用 No.6507-5 - 2017/12/05 (火) 15:46:09 - qq ＞だとしても、二重消化する意味ないと思わない？ そりゃまあ、そうだけど、詳細を聞かないと、意味がないとは言い切れないかも。 それよりも、「BamHIで切るところをHindIIIで切っていては、繋がんないよ」ということ。

(無題) 削除/引用 No.6507-4 - 2017/12/05 (火) 14:27:26 - AP >HindIIIではなくBamHIで切るんじゃない？？ だとしても、二重消化する意味ないと思わない？　どうせdirectional cloningにはならんのだから。

(無題) 削除/引用 No.6507-3 - 2017/12/05 (火) 14:17:07 - qq HindIIIではなくBamHIで切るんじゃない？？

(無題) 削除/引用 No.6507-2 - 2017/12/05 (火) 14:10:06 - AP ざっと見、Bgl2/HInd3 cutのベクターにBgl2のインサートを入れようとしているようだけど、私の勘違い？　そりゃはいらんよな。 Bgl2とHInd3はたぶん至適バッファーがHとMだがそこんところはどうしたの？ メーカーの二重消化時のバッファー選択チャートなんてあてにする、いつか痛い目見るよ。バッファー変えながら順次消化が一番。一時間半もインキュベートするくらいなら、30分＋30分の順次消化のほうがはるかによろしい。 コロニーが多数出たといわれても、そりゃ蒔く量や使ったプラスミド量によるんだから判断のしようがない。バックグラウンドレベルしかなくても大量にまけばいっぱい生えるっしょ。もしインサートがちゃんと入っていればそれ以上のコロニーを生じて問題がないレベルかも知れない。プラスミド量あたりなんcfuだったのか？

制限酵素処理 削除/引用 No.6507-1 - 2017/12/05 (火) 13:55:38 - montrachet 実験初心者です。ベクターの制限酵素処理が中々うまくいかずクローニングもうまくいかないため、皆様のご意見を伺えればと思います。 ベクターの調整方法としては、Bgl�UとHind�Vで37℃、1時間30分でdouble digestionを行った後に、念のためCIAP処理（50μLの反応系にそのままCIAPを1μL加えてます）を37℃、30分行い、アガロースゲルで電気泳動をしてバンドを切り出しています。インサートはBgl�Uのみで37℃、1時間30分で処理し、同様にアガロースゲルで電気泳動をしてバンドを切り出しています。 ベクター＋インサートでライゲーションするとコロニーを多数認めるもののコロニーPCRをすると全く入っていません。そこでベクターのみでライゲーションしてみると同様にコロニーが多数できてしまっています。 原因として、Bgl�UとHind�Vの切断部位が近接(数十bp)しており、電気泳動をしてもベクターの切れ残りを分離できていないことが考えられます（綺麗な一本のバンドにしか見えません）。このような場合、どういった点を改善すれば良いと考えられますでしょうか。アドバイス頂けますと幸いです。

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