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(無題) 削除/引用 No.650-20 - 2012/06/21 (木) 21:28:59 - 中年 PVDFならポンソーでなくともCBBで大丈夫ですよ。 それから、セミドライで慣れている方がウェットを使ってありがちなトラブルは、スポンジ（？）が洗浄後に絞ったりすることでヘロヘロに変形していて、タンクにセットした後にメンブレンとゲルの間に隙間が生じることです。的外れかもしれませんが、騙されたと思って検討してみてください。

(無題) 削除/引用 No.650-19 - 2012/06/21 (木) 11:19:20 - USF postdoc >ポンソーS染色あたりでタンパク質の転写状態を、濃さ・ムラを中心に確認する方が良いのではないでしょうか。 ついでに転写後のゲルも染めれば、残存状態も確認できますよ なるほど、おっしゃるように転写効率の確認をきちんとするのが一番ですよね。 さっそく試してみようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.650-18 - 2012/06/21 (木) 10:39:50 - TS 私も同じ機器を使用しております。 標準的なTowbinのバッファーですね。全く問題ないと思います。 転写条件も、バイオラッドの標準プロトコールにほぼ準じているようですし、 問題ないと思います。 ちなみに、転写の確認を分子量マーカーを基準にしているような印象を受けたのですが、どうなのでしょうか？ 分子量マーカーによるかもしれませんが、マーカーの移りの濃い・薄いは、実験ごとには多少は違うとは感じます（私の場合は、ですが）。 それよりも、ポンソーS染色あたりでタンパク質の転写状態を、濃さ・ムラを中心に確認する方が良いのではないでしょうか。 ついでに転写後のゲルも染めれば、残存状態も確認できますよ。

(無題) 削除/引用 No.650-17 - 2012/06/21 (木) 09:53:41 - USF+postdoc > TS さん 1x Transfer Buffer組成 Tris 25mM Glycine 192mM Methanol 10〜20% (用時調整) pH 8.3 装置 Mini-PROTEAN Tetra Cell (BioRad) 電圧、時間 １）90minでやる場合 80V, 90min Bufferは4℃に冷やしておいたものを使い、 空いているスロットに氷入りのブラスチック容器を入れます。 タンクの周りは氷をしきつめたバットを置いときます。 ２）Overnighの場合 20V, overnight Bufferは4℃に冷やしておいたものを使い、 空いているスロットに氷入りのブラスチック容器を入れます。 Cold Room内で転写させます。 上記のようにしていますが如何でしょうか

(無題) 削除/引用 No.650-15 - 2012/06/20 (水) 21:57:30 - TS タンク式ですか？ じゃあ、転写バッファの組成、時間、温度、電圧の条件を提示してみては？

(無題) 削除/引用 No.650-14 - 2012/06/20 (水) 21:26:57 - モモ PVDFの親水化などという、誰も困っていないことをいちいち聞いているのは、きっとトランスファーを一度もやったことがない人だろうと思って眺めてましたが、違うんですね・・・ メタノールに１秒浸してバッファーに１分も浸せばOKですから、あなたの実験がうまくいかないのは恐らく他のステップのせいだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.650-13 - 2012/06/20 (水) 19:59:46 - USF postdoc >メタノールに一瞬以上浸かること、その後、脱塩水に入れて乾燥しないこと >bufferを丁寧に除きすぎると、ゲルの上に置く際に細かい泡をトラップしがちということはあるかも・・・ゲルの上をbufferが被っているような状態でメンブレンを置き、その上にろ紙を積んだ後に余分のbufferを取り除くように なるほど、いろいろな御意見ありがとうございます。 以前いたラボでセミドライでやってた時、メンブレン→ゲルの順番でサンドイッチしてましたが、メンブレン表面に少しバッファーが残るような状態で置いて、その後、transferbufferに浸しておいたゲルを急いで上にのっけてました。(というのはゲルからメンブレンに転写される時、両者の間にBufferが少しはないと蛋白が移動できないんじゃないかと考えてたから) 今のラボではウェット方式の機械しかないので、それでやってますが、周りの人がこのステップにそれほど気をつかわずにやってるので、自分も、ウェット方式だとそうなのかなぁーと思って、以前ほど気をつかわなくなりました。それが原因かどうか分からないんですが、あんまりうまくいってません。他に何か補足なりアドバイスなどございましたら教えていただけたらと思いますが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.650-12 - 2012/06/20 (水) 14:57:04 - Q >どこかのサイトでPVDFをメタノール→1x Transfer Buffer どこのサイト？誰が書いたもの？ そういう情報に振り回されるのもどうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.650-11 - 2012/06/20 (水) 14:51:50 - う 話の腰をおるようで申し訳ないのですが、 我々（少なくとも私）は、化学的なことに疎いのではないかと。 そんな者たち（少なくとも私）が、 どのような素材か熟知しているとは言えない（少なくとも私は） 膜について、どうこう言うよりも、 取扱説明書で指示してあることを忠実に守ること これが一番なのではないでしょうか・・・。 その作業をした上で、 「このメンブレンはあまり良くない」 とかいう情報を交換する方が有益ではないかと。

(無題) 削除/引用 No.650-10 - 2012/06/20 (水) 14:03:07 - 中年 私も皆さんと同意見です。 セミドライのブロッティングなんですよね？ゲルの上にPVDF膜を置いて、その上にtransfer bufferに浸したろ紙を積んだら、最初のPVDF膜に残っていたbufferの量なんて誤差範囲だと思いますけど。 むしろ、bufferを丁寧に除きすぎると、ゲルの上に置く際に細かい泡をトラップしがちということはあるかもしれません。私はゲルの上をbufferが被っているような状態でメンブレンを置き、その上にろ紙を積んだ後に余分のbufferを取り除くようにしています。

(無題) 削除/引用 No.650-9 - 2012/06/20 (水) 12:45:44 - AP >メンブレンをTransfer Bufferから引き上げる時のPVDFの光沢、Bufferのはじきぐあい、表面に残るBufferの量などによって、Transfer終了時のラダーの転写がきれいにできてたり、そうでなかったり、結果にかなりムラででるということを経験的に知っています。 因果関係が確立されているとは言えないんじゃないか？ 気のせい、ジンクスのたぐいだと思います。 >トラブルの原因は、他にあるんじゃないでしょうか。。。 御意。

(無題) 削除/引用 No.650-8 - 2012/06/20 (水) 12:22:02 - TS トラブルがあった時にいろいろ神経質になるのはよくわかります。 ただそのあたり（メンブレンの前処理）は、あまり皆さん気にしてないと思います。 ちなみに私の具体的な作業では、 ミニゲルサイズのPVDF（バイオラッド）を10ｍL弱のメタノールに漬ける。 （100均で買ってきた、プラのトレイを使用） すっと色が変わるので（白からグレーというか、透明感が出るというか）、 メタノールを捨てて、脱塩水を入れる。 （たぶんメタノールに浸かっている時間は、15-30秒くらい。） そのまま転写作業へ入る。 メンブレンが、メタノールに浸かっている時間、脱塩水に浸かっている時間で、転写効率に変化を感じることはありません。 メタノールに一瞬以上浸かること、その後、脱塩水に入れて乾燥しないこと、だけが重要だと思います。 もちろん、わたしが使っている脱塩水の代わりに、転写バッファーを使っている人のほうが多いと思います。 トラブルの原因は、他にあるんじゃないでしょうか。。。

さまざまなアドバイスありがとうございます。 削除/引用 No.650-7 - 2012/06/20 (水) 12:01:35 - USF+postdoc > 中年さん > +(￣∠+￣+)ﾊﾛｰ+ さん いろいろなアドバイスありがとうございます。 もう少しだけお聞きしたいのですが、メンブレンをTransfer Bufferから引き上げる時のPVDFの光沢、Bufferのはじきぐあい、表面に残るBufferの量などによって、Transfer終了時のラダーの転写がきれいにできてたり、そうでなかったり、結果にかなりムラででるということを経験的に知っています。(もちろん他は同一条件で) なのでウェスタンブロットに精通している方は、もしかしてメンブレンがみた感じこういうふうになったらBufferからひきあげて、メンブレンの表面にBufferを少し残した状態にしとく、あるいはBufferは完全に切るなどといった基準をもってやっているのかなぁと。それともただメタノールに何秒、Transfer Bufferに何秒、表面にBufferが残っていようがいまいが気にしないというように機械的にやっているのでしょうか ? 何だか細かいことを気にしすぎと言われそうですが、他のステップは自信があるのですが、このTransferのステップでいつもしくじってるような気がして。

(無題) 削除/引用 No.650-4 - 2012/06/20 (水) 00:03:13 - +(￣∠+￣+)ﾊﾛｰ+ メタノール処理、秒で全然余裕.

(無題) 削除/引用 No.650-3 - 2012/06/19 (火) 19:24:05 - 中年 すみません。「メタノール全処理」は「メタノール前処理」のタイポです。

(無題) 削除/引用 No.650-2 - 2012/06/19 (火) 19:22:51 - 中年 なにか勘違いをしておられるようですが、「親水化」で色が変わるというのは、メタノールに浸したときに見られる変化のことを言っているのでしょう。試しにメタノール前処理無しにTransfer Bufferに浸してごらんになれば、その差は明らかだと思います。 このステップで問題になっているのは、Transfer Bufferで濡れないということだけなので、メタノール全処理後にTransfer Bufferに浸しているならそれで（というのはその手順に掛かる最短時間で）十分だと思います。目的タンパク質の分子量は親水性などは一切無関係です。

PVDFの親水化処理について 削除/引用 No.650-1 - 2012/06/19 (火) 19:06:23 - USF postdoc どこかのサイトでPVDFをメタノール→1x Transfer Buffer の順番で浸すのは、PVDFの表面は疎水性でそのままではTransfer Bufferを はじき、PVDF表面の細かい溝の中などにBufferが入っていかないんで、 まずメタノールで表面をしきつめて(表現が適当でないかも)、次に、 Transfer Bufferにいれることで、そのメタノールがTransfer Buffer で徐々に置換されていくようにする、とありました。 更に、PVDFが親水化するとメンブレンの色がやや変わるというような事も 書いてありました。今までいろんな人のTransferを みて話も聞いてきましたが、処理時間や表面がどんな感じになったら Trannsfer Bufferから引き上げるか、目的とする蛋白の分子量や親水性など によって処理時間を変えるかなどについての根拠に基づいた明確な 説明を聞いたことがありません。それでもうまくいく事もあるのであまり 深くつっこんで考えたことはなかったのですが、どなたかお詳しい人がいらしたら教えていただけないでしょうか ?

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