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(無題) 削除/引用 No.6498-22 - 2017/12/05 (火) 07:56:43 - 774R >新ロットは直接Wellに付きやすく250ngの抗原以上では下がってくるので、高濃度で抗原が抗体のWellへの吸着をブロックしているように見える。抗体としての活性は殆どないのでは？ 私もそのように感じます。 抗体が抗原を特異的に認識していることを確認するために、溶液に抗原を加えて競合阻害すると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6498-21 - 2017/12/05 (火) 05:02:01 - おお 新ロットは直接Wellに付きやすく250ngの抗原以上では下がってくるので、高濃度で抗原が抗体のWellへの吸着をブロックしているように見える。抗体としての活性は殆どないのでは？

(無題) 削除/引用 No.6498-20 - 2017/12/04 (月) 09:00:40 - MTP そりゃ結果が出ている以上、何かしらの要因はあるでしょう。 ただ、それについて議論する価値はない、有り体に言えば意味はないということが散々言われている訳で。

(無題) 削除/引用 No.6498-19 - 2017/12/04 (月) 01:45:53 - しんま 意外と普通しないような非常識的な実験ででたデータでも、再現性が取れる限り何かしらの意味はあるとおもう。 > （1）アッセイ系が最適化されていない（破綻している）と、なぜ2つの抗体で異なる動向を取ったのか。そもそもアッセイ系が破綻しているということで、この議論の価値もないのか？

(無題) 削除/引用 No.6498-18 - 2017/12/04 (月) 01:20:51 - あ ＞そのうえで、現在ラボで問題になっているのは （1）アッセイ系が最適化されていない（破綻している）と、なぜ2つの抗体で異なる動向を取ったのか。そもそもアッセイ系が破綻しているということで、この議論の価値もないのか？ 違いは基本的には新旧の違いでしょう？ 「そもそもアッセイ系が破綻しているということで、この議論の価値もないのか？」アッセイ系が破綻しているのに何を議論するのですか？「これをやってはいけません。それは間違ったデザインです。そこからは合理的なデータはでませんよ」と何度も言われていますよね？ （2）破綻しているとしても、あえて議論をするとすると、アッセイ系が破綻してるとなぜ新抗体で抗原量依存的にシグナルが減少するのか？抗原量が多いことが明らかで、コート量が飽和していると思われるが、それならプラトーのシグナルが得られるのではないか？ コート量が飽和しているという前提が間違いだと思いますけど。それは何度もここで言われていることだと思いますけど。そしてプラトーにはなりませんよ。抗原量がもし多過ぎていたら抗体の認識ははばかられますので、1山のピークになると思います。 （3）新しくアッセイ系を最適化して、2つの抗体で違いが認められなかったとき、この2つの抗体は同じとみなせるのか？ モノクロが同じであれば、同じでしょう。 マルトースとかも同じですか？ たとえば、同じモノクロがサンタクルズやアブカムから売られていたりします。 濃度も違えば、溶液の組成も異なります。ただそれらは同じとみなすでしょう。もち違った挙動を取るとすれば、抗体「以外」の要素によるものでしょう。ですから「この2つの抗体は同じとみなせるのか？」はみなせるでしょ。 まず抗原を振るという実験はやめなさい。無意味です。無知な上司にそう伝えましょう。 その上で新旧抗体の0.1-20マイクロg/ml程度の希釈系列を作り、プラトーになったところを100％として、その50％を導き出す抗体濃度を新旧で比較すればいいでしょう。それだけです。 そうすればこれ以上無駄な実験に貴重な抗体を割く必要もありませんし、とっとと次の実験にすすめるではありませんか。

(無題) 削除/引用 No.6498-17 - 2017/12/04 (月) 00:51:10 - May 皆さん、 様々なご指摘、ご指導ありがとうございます。 この抗体は動物実験をはじめ様々な実験で使われます。 精製されたモノクロ抗体です。 精製時の濃度には違いがあります（新：2ug/ml, 旧:0.5ug/ml) 溶液はPBSとマルトースを入れています。 抗原は購入したリコンビナントタンパク質です。 私たちもこのアッセイのプロトコールを見て抗原量や抗体量が最適化されていないことは理解していたので、旧抗体を送ってもらって来週自分たちでアッセイ系の立て直しをすることにしています。 そのうえで、現在ラボで問題になっているのは （1）アッセイ系が最適化されていない（破綻している）と、なぜ2つの抗体で異なる動向を取ったのか。そもそもアッセイ系が破綻しているということで、この議論の価値もないのか？ （2）破綻しているとしても、あえて議論をするとすると、アッセイ系が破綻してるとなぜ新抗体で抗原量依存的にシグナルが減少するのか？抗原量が多いことが明らかで、コート量が飽和していると思われるが、それならプラトーのシグナルが得られるのではないか？ （3）新しくアッセイ系を最適化して、2つの抗体で違いが認められなかったとき、この2つの抗体は同じとみなせるのか？ 皆様のご意見を無視してでの議論になっているのは十分に承知しているのですが、この実験は前任者（コラボレーター）がずっと行ってきたものを私たちが引き継いだものです。 前任者は動物実験をはじめ、多くのデータを蓄積しています。私たちが計画している実験はPK studyです。そのため、2つの抗体の比活性、ミスフォールドしていないかなど、私たちもどうしても新しい抗体が旧抗体と一緒であるということを確信してから実験を勧めたかったという背景があり、これほどまでしつこく堂々巡りの質問になってしまいました。 申し訳ないです。 まずは新しくアッセイ系を立て直してみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6498-16 - 2017/12/03 (日) 16:21:32 - AP >100ug/mlの抗体濃度以外はあまり活性が認められてなくて、おかしなことが起こっているのは確かのようです。 活性もなにも、抗体希釈列の値をプロットしたら、ブランクでも100 ug/mLの値だけ突出してるでしょう？　その傾向はすべての抗原を濃度で一致している。 それで正規の抗原抗体反応を見ているのかどうか、大いに疑義がある。そういうアテにならないデータで、値が逆転してるとかなんとか、論議できるもんじゃんないと思いますがね。

(無題) 削除/引用 No.6498-15 - 2017/12/03 (日) 13:56:55 - mon 申し訳ない。 抗体濃度を振ったELISAデータを記載していますね。

(無題) 削除/引用 No.6498-14 - 2017/12/03 (日) 13:43:54 - AP >0ng, 250ng. 500ng, 1000ng, 2000ngは96wellに入れてインキュベートした抗原量になっています。 そんなことしても、投入した抗原がどれだけ固相化されるか、ウェルごとの抗原量はコントロールできませんね。まさか全量固相化されるとか、倍々で抗原が固相化されいるとか、思っちゃいないでしょうね。 先の書き込みでバインディングキャパシティーについて書きましたが、投入量の大体が過剰量なので、抗原量（濃度）の違いは飽和に達するまでのタイムコースの違いだけで、飽和した固相化量はほとんど違いがないと思われます。プラトーに達する以前の任意の時間では固相化された量がことなっていても量比はコントロールできません。 >2000ng等は大変な量ですが、それでも旧抗体では抗原量依存的にちゃんとした傾向が認められたにもかかわらず新抗体では逆の傾向が認められていることがいまラボで問題になっていて、だれも納得のいく説明ができていないため、今回投稿させていただいています。 そもそも理屈に会っていない実験デザインで、理屈をもとめてもナンセンスじゃないですか？ ちゃんとした（オーソドックスな）実験手法や化学の反応論の基礎知識があって、理論的に思考できる科学者は、教員やスーパーバイザーを含めラボにだれもいないっていることですね。

(無題) 削除/引用 No.6498-13 - 2017/12/03 (日) 11:28:18 - mon もしかして「抗体量は100ug/ml」って、IgG濃度ではなく総血清タンパク濃度ってことはないよね。

(無題) 削除/引用 No.6498-12 - 2017/12/03 (日) 11:26:30 - mon >問題は新ロットですがepitope: 0ug (0.462), 250ng (1.270)... 抗原がタンパク（高分子）なのかそれ以外（小分子）なのか不明なので、コメントが難しいところもありますが、皆さんも指摘していることに同意した上で... 新ロット抗体の方が比活性が高くて（というか正常）、早めに飽和しているのではないでしょうか？ epitope: 0ugでのシグナルが高い原因として多いのは、抗体濃度が高すぎることです。比色定量もOD>1あたりから通常飽和してくるし（線形でなくなる）。 ELISAで使う抗体濃度は、通常0.1-1ug/mL程度（濃くても10以下)だと思います。 過去のデータ蓄積があるので...に関して (ELISAの目的を私が誤解していなければ）旧ロット抗体でのepitope定量データは（検量線があるから）信頼できるわけで、新ロット抗体もその比活性に見合った検量線を適切な抗体濃度・エピトープ濃度（測定原液が濃ければ希釈する）で作製して測定すればよいだけだと思います。 ポリクロ抗体だとロット(個体）によって比活性が変わることがまま有りますよ。なのでELISAメーカー（？）の方は、は「さじ加減」を慎重に検討しているわけで。。

(無題) 削除/引用 No.6498-11 - 2017/12/03 (日) 02:51:12 - しんま う〜ん、どうもコートしている抗原の量が多いために抗体がアクセスできないような事態になっているような気もするけど、よくわからない。 抗体の凝集って、遠心してるでしょ？ あと新しい抗体と古い抗体の違いってない？ たとえば溶液とか濃度とか。 この新しい抗体が使えるかはどのような実験をしているかにもよるけど、自分だったら材料（血清？）がまだあるならそれを精製してみるかな。

(無題) 削除/引用 No.6498-10 - 2017/12/03 (日) 01:28:16 - あ 基本的な素質が欠落しているのにも関わらず、一つの実験に複数の変数を加えるのはやめたほうがいい。 抗体濃度（X）、コート量（Y） これらから少なくとも必要なウェルはX*Yとなります。 96ウェルプレート一つ使うくらいじゃないですか？ポジコンネガコンを加えたら。 はっきり言って貴方にはこの実験は無理です。 基礎的な考える力がないようなら、 一つ目の実験でXを、2度目の実験でYをというように扱う数を減らしなさい。 一つ目の実験で求めたX1と、二つ目の実験で求めたY1が出たら、そこで再現性を見るためにX1とY1で見たらいいでしょう。圧倒的に扱う数が減らせますし、パラメータを複数組み込むことがどれだけ時間と資材をロスするかということがわかるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.6498-9 - 2017/12/03 (日) 01:24:04 - あ 貴方は何にもわかっていません。 貴方の上司も酵素学の基本が欠落しています。 何度も何度も言われているように、線形でコートはされません。 「違いを説明することができず」「いまラボで問題になっていて、だれも納得のいく説明ができていないため、」 これまでコメントされていることを一切合切無視するようで非常に不躾なことだと思いませんか？なぜ「線形が期待できない」ことが前提なのにも関わらず、合理的なことを求めようとしているのですか？ 今すぐにでもその無駄な100ug/mlの濃度は省きなさい。旧抗体が貴重なのではないですか？ 上司の基礎学力を疑います。 >[Re:8] Mayさんは書きました : > HDRさん、 > > ご意見ありがとうございます。 > 私たちももう一度抗原量を振りなおしてやろうということになっています。それによって、新たな最適化した系ができ、新しいロットでも活性があることが分かると思うのですが、旧ロットと新しいロットとの違いを説明することができず、ずっと続けている実験があり、旧ロットでデータが蓄積しています。それを新しいロットで変えてやっていいものか今悩んでいます。 > > AP さん、 > > 説明不足ですいません。 > 今回2つのパラメーターを取っています。 > 一つはコートする抗原量でもう一つは抗体の濃度です。 > 0ng, 250ng. 500ng, 1000ng, 2000ngは96wellに入れてインキュベートした抗原量になっています。 > 2000ng等は大変な量ですが、それでも旧抗体では抗原量依存的にちゃんとした傾向が認められたにもかかわらず新抗体では逆の傾向が認められていることがいまラボで問題になっていて、だれも納得のいく説明ができていないため、今回投稿させていただいています。 > もし何かアイデアがありましたら大変うれしいです。 >

(無題) 削除/引用 No.6498-8 - 2017/12/03 (日) 00:22:05 - May HDRさん、 ご意見ありがとうございます。 私たちももう一度抗原量を振りなおしてやろうということになっています。それによって、新たな最適化した系ができ、新しいロットでも活性があることが分かると思うのですが、旧ロットと新しいロットとの違いを説明することができず、ずっと続けている実験があり、旧ロットでデータが蓄積しています。それを新しいロットで変えてやっていいものか今悩んでいます。 AP さん、 説明不足ですいません。 今回2つのパラメーターを取っています。 一つはコートする抗原量でもう一つは抗体の濃度です。 0ng, 250ng. 500ng, 1000ng, 2000ngは96wellに入れてインキュベートした抗原量になっています。 2000ng等は大変な量ですが、それでも旧抗体では抗原量依存的にちゃんとした傾向が認められたにもかかわらず新抗体では逆の傾向が認められていることがいまラボで問題になっていて、だれも納得のいく説明ができていないため、今回投稿させていただいています。 もし何かアイデアがありましたら大変うれしいです。

(無題) 削除/引用 No.6498-7 - 2017/12/02 (土) 23:43:28 - AP では >epitopeのコート量を0ng, 250ng. 500ng, 1000ng, 2000ngと これは何を意味しているんだ？

(無題) 削除/引用 No.6498-6 - 2017/12/02 (土) 23:14:42 - HDR テクニカルな問題ではなく、デザインが問題だと思うのですが。 コート量を一定にして、抗体のノードを三段階とは言わずもっと希釈系列を作って比較することこそが、抗体の活性評価のデザインになります。 コート量を変えても指摘があるように線形にコートされませんよ。 前と同じようにやってほしい、とのことですが、一度その方と話した方がいいです。 僕なら、新旧どちらかの抗体を使って、コート量を振るプレ実験をします。 もっとも強いシグナルが認められたコート量を本実験で用います。 もちろん本実験では新旧どちらの抗体も評価しますが上気したように多くの希釈系列を作って、やります。

(無題) 削除/引用 No.6498-5 - 2017/12/02 (土) 22:15:26 - May APさん、 手法は大変単純で、抗原をプレートに張り付けたのちにブロッキングをして、抗体でインキュベートし、2次抗体で抗体を検出しています。 ドライアップはしていません。 前回には記載していませんでしたが、抗体の濃度もふって行っていますが100ug/mlを代表して記していました。 コート量（抗体100ug/ml, 10ug/ml, 抗体1ug/ml） 旧ロット pitope: 0ug (0.198, 0.146, 0.071), 250ng (0.320, 0.177, 0.078), 500ng (0.351, 0.210, 0.087), 1000ng (0.521, 0.268, 0.107), 2000ng (0.654, 0.327, 0.116) 新ロット epitope: 0ug (0.462, 0.127, 0.071), 250ng (1.270, 0.195, 0.080), 500ng (0.647, 0.123, 0.075), 1000ng (0.596, 0.124, 0.072), 2000ng (0.461, 0.128, 0.082)と100ug/mlの抗体濃度以外はあまり活性が認められてなくて、おかしなことが起こっているのは確かのようです。 >[Re:3] APさんは書きました : > どういう手法をとってるんでしょう。 > ELASAプレートに抗原を貼りつけているんでしょうか？　ドライアップとかして？ > > ものの本によると、ELASAプレートの結合キャパは約300 ng/cm3だそうですから、そもそも示された実験で設定された量は吸着しきれない。バラバラの程度で、操作中にポロッと剥がれているかもしれない。 > > また、プレートへの結合は線形でないというか、定量性がありません。だから、十分な濃度の抗原を一定量ずつ一定時間ウェルに入れて、すべてのウェルに同じ量の抗原が吸着飽和しているという前提で、抗体の濃度を振ってやるのが、抗体力価を評価するための普通のELASAです。 > 抗原を定量的に吸着させようとしたら、サンドウィッチELISAをするとか、プレートではなく、吸着のキャパも線形性も高いメンブレンベースでやるとかする必要があるんじゃないでしょうか。 確かにその通りだと思いますが、ラボの慣用でこの方法で行っていたので今回行ってみたところ何が起こったのかわからない問題に直面して困っています。 どうも旧ロットと新ロットは何か違うことが分かります。 そのため、新ロットが大量にもあるのですが、使えないでいます。 このELISAは2回行いましたが、同様の傾向が認められていますので、テクニカルな問題ではないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.6498-4 - 2017/12/02 (土) 22:04:55 - May HDRさん、 いろいろとご助言ありがとうございます。 実験の目的は精製した抗体の活性が以前のものと変わらないことを示すことです。 > epitope: 0ug (0.462)ということで、まあ新しい抗体の方ではバックが出やすいんだと思います。 これが問題になっていまして、なぜバックが高くなったかがよくわかりません。 > > というか、抗体量は100ug/mlで行いました。って多すぎじゃありませんか？ > それむしろ、抗体を企業から買った時に送られてくる原液の濃度くらい濃いです。 > たぶんその1％から5％くらいでも十分だと思います。 私も初めの抗体量が多すぎると思いますが以前と同じ容量で行ってくれと言われています。

(無題) 削除/引用 No.6498-3 - 2017/12/02 (土) 11:46:24 - AP どういう手法をとってるんでしょう。 ELASAプレートに抗原を貼りつけているんでしょうか？　ドライアップとかして？ ものの本によると、ELASAプレートの結合キャパは約300 ng/cm3だそうですから、そもそも示された実験で設定された量は吸着しきれない。バラバラの程度で、操作中にポロッと剥がれているかもしれない。 また、プレートへの結合は線形でないというか、定量性がありません。だから、十分な濃度の抗原を一定量ずつ一定時間ウェルに入れて、すべてのウェルに同じ量の抗原が吸着飽和しているという前提で、抗体の濃度を振ってやるのが、抗体力価を評価するための普通のELASAです。 抗原を定量的に吸着させようとしたら、サンドウィッチELISAをするとか、プレートではなく、吸着のキャパも線形性も高いメンブレンベースでやるとかする必要があるんじゃないでしょうか。

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