全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6496-4 - 2017/12/05 (火) 09:46:17 - AA このあたりは個々のケース次第なのだと思いますが、 SCRやRadなど、入れてはみたもののあまり顕著に変わった感触はありませんでした。 むしろ、プラスミドをやめてRNPのトランスフェクションにしたことのほうが 体感できる変化があったと思います。

(無題) 削除/引用 No.6496-3 - 2017/12/02 (土) 13:51:17 - HDR AA様、ありがとうございます！！ ご経験をお持ちの方からコメントをいただき、とても心強いです。 gRNA認識配列と変異導入部が比較的近接していまして、ssODN全長 190 bpを合成しようと思います。 AA様はNHEJを防ぐため何か特別なことをされていますか？ たとえばSCR7が有名どころだと思うのですが。あるいは細胞周期の同調なども聞きます。 だいたいの効率、工夫等ありましたらシェアしていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6496-2 - 2017/12/02 (土) 12:30:15 - AA 入れたい変異ではなくて、使うガイドRNAのDSB位置を中心にドナーオリゴを作ったほうがいいですよ。 DSBから数十bpくらいまでなら離れていてもきれいに入ります。 できれば認識配列内に目的の変異があるのがベストですが。 また、変異導入後の再カットは絶対に防いでください。 これをしないと変異の入ったあとに結局NHEJで潰れてしまうことが多いです

CRISPR-Cas9/ssODNを利用した１塩基置換 削除/引用 No.6496-1 - 2017/12/01 (金) 08:39:23 - HDR お世話になります。 現在ある遺伝子のエクソン内１塩基置換を導入したいと思っています。 CRISPR-Cas9システムと、ホモロジーアームを組み込んだPyggyBac transposonプラスミドを用いた騒動組替えによる１塩基置換を導入を検討していましたが、思うようにノックインされませんでしたので、やむなくssODN（１塩基置換をもたせた一本鎖DNA）をドナーとしてやってみようと考えています。 一点確認したいことがあります。 ssODNは１塩基置換を中心に、全長100ntを合成しようと思っています。 一方、このドナーをCas9抵抗性にするため、PAM配列やsgRNAの認識配列に変異（synonimous mutation）をもたせようと思っています。ただそのsgRNAの認識配列やPAM配列が5’側15-35塩基に相当しており、この部位に2箇所のsynonimous mutationを導入したとして、きちんとこのsynonimous mutationと目的の一塩基置換がゲノムに騒動組替えされるのか少し疑問です。 Cas9抵抗性にするなど、複雑なことは考えず、無難に一塩基変異だけをssODNにもたせた方がよいのか、それとも導入する変異の位置や数に関わらず、組み替わるものは変わるのか、それとも5’側をもう少し長く（今の50塩基よりもずっと長く）すればいいのか、などご指摘、ご指導いただけますと嬉しいです。 私の周りではこのような実験は初めてで、手探りで行なっている状況です。 もしうまくいけば、スクリーニングはRFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism、制限酵素断片長多型）でクローンをスクリーニングする予定です。 よろしくお願いいたします。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---