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(無題) 削除/引用 No.6495-5 - 2017/12/03 (日) 22:35:36 - 中年 RosheのEGFP抗体はどうやらfolding（maturation？）にsensitiveみたいで、SDS PAGEでのCBB染色のバンドとwesternのバンドはピークの高さがずれていました。蛍光強度とwesternシグナルが一致しないのにはそういうことも関係しているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6495-4 - 2017/12/03 (日) 22:24:40 - ３ １次抗体、２次抗体の性能にも左右されますし、蛍光タンパクと１次抗体の相性にも左右されます。私は蛍光の発現量をウェスタンで定量するのはあまり好きではありません（見た目と結果が伴うなら別に構いませんが）。蛍光を発している細胞をそのまま蛍光顕微鏡かコンフォーカルで撮影し、数十個ー数百個の細胞を無作為に選んで蛍光の輝度値の平均値を比較する方が真実に近いと思います。簡単にできますよ。 ただ、この出題からすると、そんなに神経質に気にする必要はないんですよね？発現が確認できればオッケーな感じで使っているように思います。

(無題) 削除/引用 No.6495-3 - 2017/12/01 (金) 09:55:18 - おお 蛋白の抽出効率が変わっている可能性は、、、

(無題) 削除/引用 No.6495-2 - 2017/11/30 (木) 19:36:39 - mon 目に見えるほどの蛍光というのは「実際に発現している蛍光タンパクの量が多いから」では無く、「機能的な蛍光タンパクの量が多いから」です。 WBでは「変性タンパク+機能的な蛍光タンパク」の合計をみているので、発現量が多すぎて正常にfolding出来ないタンパクが多くなる場合があります。

実際に肉眼で観察できる差と実際の蛍光タンパク質の発現量 削除/引用 No.6495-1 - 2017/11/30 (木) 18:01:28 - 蛍光 初めて質問させていただきます。 先日、eGFPとtdTomatoをそれぞれ別のプロモーターで発現させて（下記）、その細胞をPBSでwash後、スクレイパーで細胞を回収し、遠心してペレットを確認すると、GFPとtdTomatoが肉眼でも発現していることを確認しました。 promoter A-eGFP promoter B-eGFP promoter C-tdTomato promoter D-tdTomato 上記の細胞ペレットをそれぞれ確認したところ、promoter CとDではtdTomatoと思われる赤色が肉眼でもわかるくらい差がありました(C > D)。 一応、promote CとDの細胞を使い、western blotでtdTomatoの発現量を確認したところ、肉眼ではCの方が赤かったのにも関わらず、Dの方が発現量が高いという結果が出てしまいました。 目に見えるほどの蛍光というのは実際に発現している蛍光タンパクの量が多いからでは無いのでしょうか？

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