BioTechnicalフォーラム [突然PCR後の電気泳動がうまくいかなくなった]

突然PCR後の電気泳動がうまくいかなくなった

No.6494-TOPIC - 2017/11/30 (木) 00:20:00 - 外科医

今までうまくいっていたPCRの結果が出なくなったのでどなたか教えてください。長文すいません。
マウスのFgf10遺伝子に関する解析を行っており、Fgf10遺伝子のExon1に関してPCRを行い遺伝子型判定を行っています。
マウスtailを採取しQiagen　Blood & Tissue KitでDNAを抽出します。抽出後NanodropでDNAの濃度を測定し、KOD-Plus Neo（TOYOBO)を使用してPCRをかけています。総量を50μℓとしてDNAテンプレートは100ng使用しています。プライマーの配列はFが5′-CAGCAGGTCTTACCCTTCCA-3、Rが5′-TACAGGGGTTGGGGACATAA-3′でこれは様々な論文でも使用されています。反応液の調整は取り扱い説明書に準じており、dNTPを0.2ｍM、MgSO4を1.5mM,
プライマーは0.3μMとしています。サーマルサイクラーの設定は94℃で2分、その後98℃10秒、60℃10秒、68℃30秒で35サイクルとしています。産物は521bpで、電気泳動をすると500bpのマーカー付近にバンドが出現します。しかし、ある日を境にどのサンプルもスメアとなってしまいバンドが描出されなくなりました。DNAの断片化なども考えたのですが、Exon3用のプライマーを使用するとどのサンプルもきれいなバンドが描出され、可能性は低いのではないかと考えています。以前はExon1についてもExon3と同様に描出されていました。試薬を全て一新しサーマルサイクラーも新品にしてトライしても結果は変わりませんでした。同じ条件で同じ研究室の先生方にもトライしていただきましたが、同様な結果でした。ただ、他教室のテクニシャンの方がしたところバンドが描出されました（サーマルサイクラーは異なる会社の機器でした）。しかしながらその後何度もトライしても描出できずテクニカルな問題だけではないと考えています。サーマルサイクラーの条件設定を少し変え、アニーリング温度を64℃としてサイクル数を30サイクルに減らしたところ薄くバンドが見えるようになりましたが、増幅産物の収量が十分とは言えない状況です。
突然のことで、研究進まない状況となっております。どなたか御教示願います。
　

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No.6494-10 - 2017/11/30 (木) 17:48:05 - AP

PCR産物は何に使うんだろう。
クローニングするのでもなければKOD-Plus Neoは使いにくいんじゃないか？
個々のPCR産物分子の塩基配列の正確性が必要な実験（クローニングやコンストラクト作成）のために正確性を高めている代わり、増幅しやすさとか堅牢さ（悪条件でもよく働く）は犠牲になっている。

KODシリーズならKOD Fx Neoのほうが増幅の良さや堅牢さではるかに勝る。正確性も悪くない。こういう酵素のほうが向いている実験なんじゃないか？

(無題)

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No.6494-9 - 2017/11/30 (木) 17:32:24 - 他に

経験則ですがKOD plus系の酵素はMgSO4の濃度やテンプレート量が増幅効率に割と影響する気がします。バンドがスメアな場合はMgSO4を減らすとシャープになりますし、増幅が見られない場合は増やすといいです（マニュアルにも載っていたかと）。テンプレートも少なめのほうがPCRのかかりがいい場合があるので、濃度を振ってみてはいかがでしょうか。

(無題)

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No.6494-8 - 2017/11/30 (木) 15:49:31 - たぶん

他ラボでうまくいくのなら、ピペットマンが汚染している可能性もあると思います。

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No.6494-7 - 2017/11/30 (木) 15:00:50 - AP

「突然PCR後の電気泳動がうまくいかなくなった」
というタイトルですが、うまくいかなくなったのは電気泳動ではなくPCR反応ということでいいですね？
マーカーの分離は問題ない、他のPCR産物ではちゃんと出る、んでしたね。

試薬一新してもダメということですが、プライマーはどうでしたか？
mother stockから希釈しなおした？新しく合成しなおした？
他の標的配列（exon 3でしたっけ）がちゃんと増えるってことですから、試薬も鋳型も問題ないはずで、プライマーがおかしくなったと考えるのが妥当かなと。

プライマーが削れていたりすると、正規の標的の増幅が悪くなり、特異性が下がりスメアになる？
サイクル数を下げるとスメアがマシになるのは不正なPCR産物が重合してスメアがひどくなっているから？

(無題)

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No.6494-6 - 2017/11/30 (木) 10:38:08 - あるある

ゲノムPCRのときは、最初の熱変性を念入りにしてます。
95℃10分とか。
おまじないかもしれませんが。。

アドバイスありがとうございます。

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No.6494-5 - 2017/11/30 (木) 09:16:21 - 外科医

おおさん貴重なアドバイスありがとうございます。
御教示いただいた内容について再度トライしてみます。
ちなみにDMSOは試してみましたが（2％、5％）、いずれの濃度でもバンドは認められませんでした。

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No.6494-4 - 2017/11/30 (木) 08:15:10 - おお

同じ反応液、環境で一方はかかって他方はかからないという状況なので、かからなくなったほうが至適条件の幅が狭く難しいと言えるのではとおもいます。

PCRの特異性をあげれると思っているいくつかの事を以下に書いてみます。

一番単純なのはベタインなどを使ってみる。DMSOなどもいいかもしれませんが、ベタインのほうがより有効かなと。GCリッチでよく使われるのですが、そうでなくても有効な場合もありますし、これを加えて増えなくなるというのは経験したことがありませんので、デフォルトで入れておくというのもありかと思います。濃度などはググったりすると出てくると思います。

タッチダウンで増やす。特にゲノムなど複雑性の高いサンプルからのPCRで特異性を出すのに有効と言われています。アニーリング温度を高い温度で最初設定して、サイクルごとにアニーリング温度を少しずつ下げていく方法です。最初アニーリング温度を６８度にして、徐々に下げていき最終５５度あたりにしてもいいかもしれませんでそうですね、、、３５サイクルぐらいでしょうか。この方法だと至適温度を探る必要もないので、かかればいい場合は最初からこれで済ませるというのもありかと。

アニーリング温度を長めに取る。プライマーが特異的な部分を見つけて安定な状態にならないといけませんから。もちろん短くすることでもある状況下では特異性を上げることができますが、今の条件は十分短いですから。

伸長反応の長さ。これは状況次第です。目的のバンドより長い副産物がなく、短い方にノンスペがあるとき伸長反応が不十分でノンスペを増やしてしまっている可能性がありますから長くしてみる。逆に長いノンスペがある場合は短くしてみる。

プライマーをかえる。確かに文献上、経験上かかるということですが、増やすのが難しそうなのでプライマーを変更する事によってもっと楽にならないかということです。長さも特にゲノムなら２３から２８マーぐらいの長さにすることが多いです。３’側はCかGにしておくほうが良い（必ずしも必須ではないけど）と言われています。
5′-CAGCAGGTCTTACCCTTCCA-3こちらは３’端のAをとり、５’側数ベース伸ばすとか、
5′-TACAGGGGTTGGGGACATAA-3こちらはちょっとGが多すぎます。Gが並べば並ぶほど合成も難しくなり、そうすると高純度に精製しても合成しやすいものよりも副産物を引きずっている可能性もあります。5′側のTACAGG-3をとって更にそこから５’側に伸ばせばどうかなと何となく思う次第です。２３から２８マーと幅がある中でGC量の違いによる両者のTmは長さである程度で調整できます。プライマーのいちに制限があるときもありますのでそうは行かないかもしれませんけど。

酵素を変える。最近でいい酵素と噂があるのはPrimeStarとNEBが出している（名前は思い出せない）ものかと。酵素が違うだけでかかったりかからなかったりすることは結構あります。今の酵素を使いながらも、それでかからないものだけは違う酵素を使うとか言うのも手かもしれません。

(無題)

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No.6494-3 - 2017/11/30 (木) 01:48:17 - 外科医

> 一新した試薬をどのように新規のものにしたかすべて記載して下さい。
KOD-Plus Neoの新しいキットをいくつも購入しました。
プライマーも4社程度購入し、精製度が高いものも試しました。

> KODは分注していますか？以前大丈夫だったので今も大丈夫とか、ex3で大丈夫だからex1でもPCRできるはずだとはいえないのがPCR酵素です。ちょっとした冷凍庫の出し入れでもわずかずつ失活していきます。もし、KODを最初に買ったチューブのまま使用していて、購入してから時間がたっている場合はまずPCR酵素の問題でしょう。外科医なら、KODの購入費用よりもあなたの時間のほうがはるかに貴重です。でるかでないかはっきりしないKODは投げ捨てて、さっさと新しいKODを購入しましょう!

KODの分注はしていません。そもそも1キットが200回分で、サンプル数も多いので早く使い切ります。
新しいKODで試してもうまくいかないので困っています。

(無題)

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No.6494-2 - 2017/11/30 (木) 01:24:23 - 小児科医師（ゆとり教育）

>試薬を一新して

一新した試薬をどのように新規のものにしたかすべて記載して下さい。

極端な話、全て新品で購入すれば絶対にうまくいくはずです。それでうまくいかないならプライマーの設計がおかしいのですが、以前はうまくいっていたとのことなのでそれはないです。たぶんですが、私の勘では、KODが失活してきているんじゃないかなーと思います。バッファーはそんな簡単に変性するものではないし、DNAだってマンモスから採取できるくらいだから断片化が原因ではないと思います。それに断片化したって、genomic DNAがPCRできなくらいまで断片化するって結構なことですよね？

KODは分注していますか？以前大丈夫だったので今も大丈夫とか、ex3で大丈夫だからex1でもPCRできるはずだとはいえないのがPCR酵素です。ちょっとした冷凍庫の出し入れでもわずかずつ失活していきます。もし、KODを最初に買ったチューブのまま使用していて、購入してから時間がたっている場合はまずPCR酵素の問題でしょう。外科医なら、KODの購入費用よりもあなたの時間のほうがはるかに貴重です。でるかでないかはっきりしないKODは投げ捨てて、さっさと新しいKODを購入しましょう!

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No.6494-1 - 2017/11/30 (木) 00:20:00 - 外科医

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