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(無題) 削除/引用 No.649-2 - 2012/06/19 (火) 19:54:05 - qq いつものように経験はないですが、3H標識でイメージングプレートは、かなり感度が足りなかったりしませんか？ 乾燥したゲルをIPに接触する必要がありますよね。サランラップもだめだと聞いたような、そうでないような？ 現在、14C標識のSAMは入手可能なのでしょうか？IPには、3Hよりも14Cの方が簡単ではありますよね。 ウェルの底に溜まっている3Hが何かは問題だと思いますが、3H-SAMから別のDNAなどへのメチル化が生じる可能性は無い条件なのでしょうか？でかいDNAにメチル化して、それが溜まっていて、感度不足でヒストンのメチル化は見えないけれど、他のメチル化が見えている可能性は、いかがでしょう？ 最後に、解決に繋がるかもしれない提案として、ゲルのレーンの上から下まで、２ｍｍずつ切り取って、液シンで3Hを測定してみましたか？もしくは、ヒストンのバンドをCBB染色して、3Hカウントを液シンで測定してみてはいかがでしょう。

メチルトランスフェラーゼアッセイ 削除/引用 No.649-1 - 2012/06/19 (火) 18:34:42 - tritium アイソトープ実験の初心者です。 現在、ヒストンH3(Roche)を基質として、トリチウムラベルされたSAMを用いてメチルトランスフェラーゼアッセイを行っています。 酵素反応後、SDS-PAGEを行い、ゲルを乾燥して、イメージングプレートで検出しているのですが、どうもうまくいかず困っています。 トリチウムのシグナルは見えるのですが、ランニングゲルの上の方に固まったような見え方で、トリチウムだけ流れていない(？)ような感じがします。 アイソトープの実験ではこのようなことが起こるのでしょうか？ 酵素としては既知のヒストンメチルトランスフェラーゼを用いており、他の論文でもメチル化が入ることが確認されています。 TAPタグがついたタンパク質をIgGセファロースビーズで回収し、そのビーズに直接反応液およびSAMを添加して反応を行っています。 その後、サンプルバッファーを加え、ボイルした後、泳動しています。 他の論文では、TAPタグによる精製(TEV処理、カルモジュリン精製)まで行ったものを酵素として用いているのですが、そのまま用いるのは精製が不十分なのでしょうか？ キナーゼアッセイはprotein Aビーズで落としたものをそのまま使ってうまくいくようですが、メチル化のアッセイではうまくいかないのでしょうか？ それとも、トリチウムラベルしたものはボイルするとおかしくなるのでしょうか？ 似たようなご経験がありましたら、ご教授お願いします。

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