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(無題) 削除/引用 No.6487-14 - 2017/11/29 (水) 05:00:32 - おお pCDH-CMV-GFPはpUC oriですね。もしプラスミドが大腸菌に悪さするのであれば、大腸菌の増えが悪いかと思います。そうでなければ何らかの原因で目的のプラスミドを持たないものが混じっている可能性があるかもしれません。そういうのは長期保存されたプラスミドを含む大腸菌とかストレスを受けた大腸菌を扱った場合にたまにあります。なのでどの段階にしろ一度シングルクローンにして扱ったほうがいいでしょう。 その段階で増殖が悪いならプラスミドが悪さしていると結論付けられますし、そうでないならハンドリングの問題だったといえるでしょう。 最初にTransformationを行った段階からシングルをひろうともしかしたらハズレを拾う確率も若干高いかもしれません、

(無題) 削除/引用 No.6487-13 - 2017/11/29 (水) 02:50:22 - プラスミド monさん そのようなことがあるのですね。ありがとうございます。 一つはpCDH-CMV-GFPというベクターですが、おそらくsystembioのものです。 確かにトランスフェクションでGFPが陽性になっていました。 あまりこの会社にはいい思い出がありませんが、、、。 pluというプラスミドは私も知りませんでした。 >[Re:11] monさんは書きました : > ＞空ベクターで増えないというのが不思議です。 > 経験例では、あるpromoterとあるpolyA領域が隣接していると収量が少ない時がありました。接続部位の制限酵素部位も切れにくかったので、DNA複製も進行しづらい（コピー数が少ない）のかもしれません。plasmidの構成が不明なので参考まで。

(無題) 削除/引用 No.6487-12 - 2017/11/29 (水) 02:47:29 - プラスミド 小言幸兵衛様、 一度洗うことが重要なこともあるのですね、、、。 最初に遠心した時に大腸菌のペレットのぎりぎりまでいつも吸っていますし、それを100mlのLB培地で震盪培養するので感覚的にはどれほど改善するのだろうと疑問が残りますが、次回はそれを取り入れてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6487-11 - 2017/11/28 (火) 06:40:24 - mon ＞空ベクターで増えないというのが不思議です。 経験例では、あるpromoterとあるpolyA領域が隣接していると収量が少ない時がありました。接続部位の制限酵素部位も切れにくかったので、DNA複製も進行しづらい（コピー数が少ない）のかもしれません。plasmidの構成が不明なので参考まで。

(無題) 削除/引用 No.6487-10 - 2017/11/27 (月) 21:49:25 - 小言幸兵衛 問題ないプラスミドに関しては遠心すら必要ないかと思いますが、そうでないケースでは一度、培地で洗うくらいの用心が必要なこともままありますよ。

(無題) 削除/引用 No.6487-9 - 2017/11/27 (月) 19:19:17 - ぷらすみど 小言様 bラクタマーゼ持ち込みを低減するために遠心して再度新しいLB培地で懸濁しています。ので大丈夫かと思います。 やはりシングルを拾うべきですよね。 プレートは次回作り直す予定です。理由は再現性を見たかったのですが、作り直すべきでした。

(無題) 削除/引用 No.6487-8 - 2017/11/27 (月) 17:45:57 - 小言幸兵衛 皆さんのおっしゃることに同意した上でいくつか気づいたことを。 １．プラスミドを増やし直すときシングルコロニーを取るべき。 ２．ミニカルチャーを遠心してミディに植菌するのは、βラクタマーゼの持ち込みが大きいので避けるべき。 ３．２度めにやり直したときに「このような異常な方法」を避けてプレートを作り足さなかったのはなぜ？

(無題) 削除/引用 No.6487-7 - 2017/11/27 (月) 17:35:03 - プラスミド mon様 ありがとうございます。 コロニーは生えるんです。大腸菌の増えも変わりありません。 LBプレートへのプレーティングをいい加減にしているので、ミニカルチャーはシングルコロニーを拾っているわけではないんです。たくさんのコロニーを一つのチューブでミニカルチャーしています。。 空ベクターで増えないというのが不思議です。 ろ紙の？phageへの感染であれば、ミディプレップしたもので形質転換し直せばいけるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6487-6 - 2017/11/27 (月) 16:47:50 - mon コロニーが出現しない事と収量が少ない事は、別の理由です。 コロニーが出現しない理由は、抽出が成功していない（狙い・的がはずれた？）か、元々のスポットしたDNAが少なく形質転換に失敗した（コンピの効率が悪い）ことが考えられます。よっぽどでない限り真ん中にスポットしていると思うので、濾紙（円の中心部分5-10mmほどで十分）から抽出したものでやり直すのがbetterです。あるいは多めのTEで円内を濡らして抽出＞共沈剤を添加しEtOH沈殿して濃縮＞形質転換かな。。 収量が少ないのは、もともとのplasmid（vector＋insert)の性質なので（コピー数が少ない）、改善はしないでしょう。念のため、提供元に収量が少ない旨の是非を聞いてみてもよいかも。 Low copy plasmidと考えて培養量を増やすのが良いと思います。 また念のため収量が少ないものは、制限酵素等で欠失を調べた方がよいです。

(無題) 削除/引用 No.6487-5 - 2017/11/27 (月) 16:46:05 - AP あとphageによる汚染

(無題) 削除/引用 No.6487-4 - 2017/11/27 (月) 16:09:33 - プラスミド AP様 ありがとうございます。 増えの悪いプラスミドには、空ベクターも含まれているんです。 その空ベクターにある遺伝子がクローニングされていて、その野生型とミスセンス変異を持つ遺伝子はきちんとプラスミドが取れていましたが、別の部位のミスセンス変異があるものでは空ベクター同様、収量が著しく低かったです。 pCDH-CMV-GFPというのが空ベクターです。 pLU-CMV-MCS-iGFPという別の空ベクターも増えませんでした。 それにクローニングされた野生型遺伝子は増えましたが、ミスセンス変異を持つ両プラスミドはいずれも増えませんでした。 なので、遺伝子が悪さをしているようには思えないんです。すみません情報を後出ししてしまい。空ベクターでも増えないというのが、、 ちなみにミニカルチャーの液は一度遠心して上清を除いたのち、新しいLB培地で再度懸濁し直してから、ミディカルチャーしています。

(無題) 削除/引用 No.6487-3 - 2017/11/27 (月) 13:56:45 - AP >ただし、pBRなみにコピー数が減るために、収量は高コピー数プラスミドの1/10くらいになるかもしれない。 最近数が十分に増えたところでクロラムフェニコールをぶっこんで、37℃にもどしたらいいかしらん。

(無題) 削除/引用 No.6487-2 - 2017/11/27 (月) 12:15:11 - AP いったん形質転換して精製したプラスミドで形質転換しなおすのはもちろん構わないが、多分、解決にはならないだろう。 おそらく、それら増えの悪い、あるいは形質転換効率の低い、プラスミドは大腸菌内にとって毒性を発現するのだろう。 pUC系のレプリコンなら、 温度を下げることでコピー数を減らし、生存率が上がるかもしれない。ただし、pBRなみにコピー数が減るために、収量は高コピー数プラスミドの1/10くらいになるかもしれない。 ベクターの構造によっては（lacZのクローニングサイトに入っているとか）なら、DH5alphaはやめて、JM109とかXL1-BlueのようなlacI^q系統を使った方がいいだろう。他にもタンパク質発現用宿主で毒性タンパク質に強い系統（C43など） を使うのもいいかも（だたし、クローンイング用宿主ではないのでRec+だったとおもうが）。

ろ紙からのプラスミド抽出に関して 削除/引用 No.6487-1 - 2017/11/27 (月) 05:55:25 - プラスミド お世話になります。 共同研究先の中国の研究機関から10個のプラスミドが送られてきました。 各ビニール袋に5cm平方のろ紙が入っており、その中央部に2cmの直径の円がかかれてあり、各円の上にプラスミドの名前がマジックでかかれてありました。 そこでその円の下半分を切り、それを1.5mlエッペン内にどうにか収め、そこへ150ulのTEを加えて、室温10分放置したのちにマックスで遠心し、その上清をDH5aに形質転換しました。 LBプレートが手元に3つしかなかったので、そのプレートをピザの生地のように4等分して、カッターナイフで等分したLBプレートが接触しないように溝を作りました。 その後、形質転換した大腸菌のドロップレットをプレートに落とし、翌日コロニーピックをしました。 （もちろん普段はこのような異常な方法はとっていません。きちんとスクレーパーで引き延ばしています） 10個のうち、ぎっしり生えるものもあれば、1個しか生えないものもありました。 すべてをミディプレップしたところ、5個で100-200ugほどのプラスミドが取れましたが、残り5個からは10ugも取れませんでした。 10個のすべてのプラスミドにはGFPが発現するような哺乳動物細胞用プラスミドですので、それぞれすべてを293Tに導入し、フローサイトでGFPをみたところ、一応すべてのプラスミドでGFPがバンバンと発現していましたことから、プラスミド自体は壊れてはいなさそうです。 ただ、収量が著しく低いみたいです。 全く同じ方法で再度ろ紙から形質転換し、LBプレートに同じ方法でドロップレットを垂らしてそこから拾ったコロニーからもミディプレップでわずかしかとれませんでした。 そこでみなさまにお聞きしたいのですが、こういった場合、もちろんLBプレート一面に均等に撒いて、そこからコロニーをいくつかつついてまずはミニプレップをすべきだとは思うのですが、この時の形質転換のプラスミドは、⑴ろ紙から再び形質転換した方がよいのか、⑵ミディプレップしたごく僅かなプラスミドを用いて形質転換した方がよいのか、ご相談させていただいてよろしいでしょうか？ すみませんがどうぞよろしくお願いいたします。

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