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(無題) 削除/引用 No.6457-18 - 2017/11/16 (木) 13:38:10 - 中年 ごろごろさん、 追加です。沈殿が大きすぎるのも嫌だったので、1サンプルあたり5ugのLPAを使いました。

(無題) 削除/引用 No.6457-17 - 2017/11/16 (木) 12:49:55 - ごろごろ 中年様 ありがとうございます。今度試してみたいと思います。 おお様 ゲル板かキャピラリーかわからなかったので・・・。

(無題) 削除/引用 No.6457-16 - 2017/11/16 (木) 09:48:01 - 中年 EDTA入りEtOH沈殿で通常短いところに出るダイのピークも無く、プライマーの近くから読みやすいのも利点です。 シークエンスキットをケチって1/4の濃度、半分のスケールで反応を行なっていたのですが、EDTA入りEtOH沈殿で精製したサンプルと同じ条件でインジェクションしたらシグナルが飽和してしまって、これならもっとケチれるなと思いました。 条件は通常の0.3M NaOAcを用いたEtOH沈殿で、2.5 volのEtOHを加えたらすぐに室温で遠心していました。難点といえば、LPAの沈殿がチューブから剥がれやすいことくらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6457-15 - 2017/11/16 (木) 09:39:18 - おお https://mullinslab.microbiol.washington.edu/protocols/linear_acrylamide_carrier/ キャリアーが必要かどうかに関しては、ngオーダーならペレットが見えなくてもちゃんと回収できますけどね（若干気をつけないとロスしますけど）。なのでプラスミドの切った貼ったの作業では必要性はあまり感じない。

(無題) 削除/引用 No.6457-14 - 2017/11/16 (木) 09:37:19 - 中年 はい、ABIのキャピラリーシーケンサーに用いて全く問題ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6457-13 - 2017/11/16 (木) 09:25:23 - おお キャピラリー式も蛍光...

(無題) 削除/引用 No.6457-12 - 2017/11/16 (木) 08:38:18 - ごろごろ 中年様 >蛍光サイクルシークエンスの産物精製に使うようになったら、EDTA入りのエタ沈やってた頃に比べてバックもきれいだしシグナルが5倍くらいになってびっくりしました と、いうことですが、これはキャピラリー式のシークエンサーにも使えますか？

(無題) 削除/引用 No.6457-11 - 2017/11/16 (木) 08:16:57 - 小言幸兵衛 glycogenを使ったサンプルからPCRしたら、牡蠣のホモログが取れたという笑い話（都市伝説？）がありました。

(無題) 削除/引用 No.6457-10 - 2017/11/16 (木) 07:39:48 - ふみ グリコーゲンが酵素反応を阻害すると昔教わり、そうだと思ってきました。 あまりきちんとした根拠がないようで、反省しています。 Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25; 18(2): 378. あたりが関係しそうですが、共沈に通常使われる濃度ではそれほど問題ないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6457-9 - 2017/11/16 (木) 00:12:20 - おお グリコーゲンをよく使ってました。

(無題) 削除/引用 No.6457-8 - 2017/11/15 (水) 23:30:45 - AP >グリコーゲンはligationを阻害するということから よろしければ出典お願いします

LPA自作に一票 削除/引用 No.6457-7 - 2017/11/15 (水) 22:57:23 - ふみ 私も自作LPAを使っていて、まだ数十年分ぐらい残っています。 グリコーゲンはligationを阻害するということから、LPAの方がよいと思います。 LPAにしてもグリコーゲンにしても色は着いていないですけれどね。

(無題) 削除/引用 No.6457-6 - 2017/11/15 (水) 22:49:18 - AP >専用品として売っているのはワンチューブ1000 uLくらいで万円オーダーだったりするので馬鹿らしくて買う気になりません ゼロを一つ余計につけてしまいました。100 uL あるいは100回分でそれくらい、

(無題) 削除/引用 No.6457-5 - 2017/11/15 (水) 21:20:31 - 中年 うちのラボも私が昔作ったLPAを皆で使っていますが、とんでもない額の研究費が当たってラボの人数が急増しないかぎりは15年くらいもつかな。 キャリアーはいいですよ。雑にエタ沈してもロスがない。蛍光サイクルシークエンスの産物精製に使うようになったら、EDTA入りのエタ沈やってた頃に比べてバックもきれいだしシグナルが5倍くらいになってびっくりしました（今は外注なので関係ないですが）。

(無題) 削除/引用 No.6457-4 - 2017/11/15 (水) 20:38:24 - mon エタ沈メイトは自作出来ますよ。 ttp://www.uvm.edu/~tpdelane/lab/protocols/LinearPolyAcryl.htm 私はBlue Dextranを多用しています。 1mg/mL TE（オートクレーブ可）を作製して、DNA溶液＜200uLなら5uL加え、3M NaOAc 1/10vol, 2 vol EtOHを加え、直ぐに遠心しています（Max rpm. 10min)。 沈殿が青くなって良いですよ（DNA溶液もうっすら青くなるので、溶かしミスがなくなります）。 詳しくは、blue dextran dna precipitationで検索してください。

(無題) 削除/引用 No.6457-3 - 2017/11/15 (水) 20:35:21 - AP エタチンメイトとは、ニッポンジーンだったかの商標で一般名じゃないですね。 一般的にはエタノール沈殿用の「共沈剤」あるいは「キャリアー」と言えば通じます。 よく使われるのはグリコーゲン、最近じゃlinear polyacrylamideなんかが台頭。 どちらも、自作できます（試薬級のグリコゲンをPCI／CIAA抽出、クロスリンカー無しでアクリルアミドを重合、洗浄）。数千円のコストで、一度作れば今後10年は使えるくらいできます。 専用品として売っているのはワンチューブ1000 uLくらいで万円オーダーだったりするので馬鹿らしくて買う気になりません。ただ、着色してあるpellet paintみたいなのは場合によっては便利なこともある。 非常に濃度の薄い核酸の時（例えば<1 ng/mL)以外、必要ないともいいますが、私は量的に少々不安であれば積極的に使うほう。初心者には沈殿を可視化してトレーニングするのにもいいかもしれない。

エタ沈メイト 削除/引用 No.6457-1 - 2017/11/15 (水) 19:38:44 - あべし 　こんにちは、いつも参考にさせていただいています。 　DNA合成でエタ沈メイトを使うことになり、購入しようと検討して 　いるのですが、様々な会社から出ていてどこで購入しようか 　迷っています。 　おすすめの会社等ありましたら教えていただきたいです。 　またエタ沈メイトを使用する必要がないという意見もありましたら 　教えていただきたいです。

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