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(無題) 削除/引用 No.6444-9 - 2017/11/07 (火) 12:51:57 - mon PCRで増やすなら、Primerに[6-7baseの足場]+[typeII制限酵素BsaIやEsp3Iの認識部位]+[目的制限酵素のcohesive end配列]を追加しておくと、制限酵素の選択肢が広くなります。

(無題) 削除/引用 No.6444-8 - 2017/11/07 (火) 10:28:25 - おお >[Re:4] Lucさんは書きました : > おおさま、 > > ありがとうございます！ > > インサートはPCRにて調製予定です。 > > 片方をSmaIというアイデアも考えたのですが、メチル化感受性ですよね？ > DH5αで調製したpGL3しかなく、メチル化酵素が欠損する大腸菌は持っていないんです。 > やはり、pGL3のSmaIはメチル化されていると考えて問題ありませんよね。 中年さんが指摘しているように、大腸菌内で起きるメチル化は関係ないとおもいます。CpG Methylationはマンマルなどの真核生物のゲノムで起こるメチレーションなので大腸菌ないのMethylationとはちがいます。SmaIはよくプラスミドのConstructionで使いますよ。 そもそも切れない酵素をマルチクローニングサイトにおいておく意味がないですし。。。 とうしても避けたいならHind IIIとかもう少し外側の酵素できって、平滑末端処理したあとにKpnIで切ればいいです。

(無題) 削除/引用 No.6444-7 - 2017/11/07 (火) 10:02:16 - AP 各社のテクニカルインフォによると、 1. 隣接した制限酵素認識配列（pUC19)でKpn 1→Sac 1の順次消化による切断効率　100%,　Sac 1→Kpn 1の順次消化 50-100% （Fermentas) 2. 認識配列の末端に1 bp付加された場合の切断効率 Kpn 1: 50-100% (Fermentas), 0-20% (NEB) Sac 1: 50-100% (Fermentas), 0% (NEB) となっています。 実際pUC19で実験したFermentasを信じれば、Kpn 1→Sac 1の順次消化するのがよさそうです。 NEBのデータからは逆のほうが良さそうなんですけれど。 ちなみにFermentasはThermoだったかに吸収されてしまってから、テクニカルインフォにアクセスできなくなってしまったようなんですが、もし昔のカタログがあれば載ってます。

(無題) 削除/引用 No.6444-5 - 2017/11/07 (火) 08:39:49 - 中年 SmaIはdamにもdcmにも非感受性なので、DH5α由来のものでも問題なく切れます。

(無題) 削除/引用 No.6444-4 - 2017/11/07 (火) 08:28:37 - Luc おおさま、 ありがとうございます！ インサートはPCRにて調製予定です。 片方をSmaIというアイデアも考えたのですが、メチル化感受性ですよね？ DH5αで調製したpGL3しかなく、メチル化酵素が欠損する大腸菌は持っていないんです。 やはり、pGL3のSmaIはメチル化されていると考えて問題ありませんよね。

(無題) 削除/引用 No.6444-3 - 2017/11/07 (火) 08:11:48 - 中年 切れにくそうだったら、pGL3をKpnI-X、X-SacI（Xはone cutの制限酵素）でそれぞれ切り出しておいて、3ピースのライゲーションをするという手もあります。XがAmp耐性遺伝子の中にあればバックはさらに低くなりますが、そうでなくとも大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.6444-2 - 2017/11/07 (火) 07:53:56 - おお https://www.neb.com/-/media/nebus/files/chart-image/cleavage_linearized_vector_old.pdf?la=en KpnIはSacIが隣り合わせの状況のpNEB１９３で切れてる。 おなじ表で認識配列に１ベース伸びた状態ならSacIも切れると書かれているけど、 https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments こちらでみるとSacIはちょっと不安要素があるので、 SacIでまず切ってKpnI追加するなどしたほうがいいかな。 万が一片方しか切れてなくってLigationで環状になってないなら、Ligation後に一度末端をブランとにしてもう一度Ligationするといいかも。 片方だけブラントならSmaIも使えるけど、Insertはどうやってとってくるんですか？PCRでSacI認識配列タグをつけているのなら、あえてそこをきらないとか。なにかからSacI・KpnIで切り出すならSacIできってブラントにしてからKpnIで消化してきりだすとか。 そういうバックアッププランはあったほうがトラブルで先に進まなく可能性がひくくなります。

pGL3をKpn1とSac1でクローニングは可能ですか？ 削除/引用 No.6444-1 - 2017/11/07 (火) 07:00:25 - Luc クローニング初心者です。 pGL3に目的の配列をクローニングする際、Kpn1とSac1しか使用できませんでした。 ベクターマップを見ると、ちょうど隣接して存在しており、制限酵素できちんとダブル消化されるか疑問ですが、やはり多少のスペースがないといけませんよね？

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