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(無題) 削除/引用 No.6443-10 - 2017/11/08 (水) 22:17:51 - くるりんぱ なるほど、そのような基準があったのですね。 とても参考になりました。 培養液のpHを調整したものと、従来の培養液とで細胞の状態を比較します。

(無題) 削除/引用 No.6443-9 - 2017/11/08 (水) 12:09:10 - mon pHが関与に関して、DMEMの元報は8％C02用なので5％下だとややアルカリ性よりです。 もしこれがストレスになっているなら、 ATCCの処方(1.5g/L)のように、NaHCO3の量を減らしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6443-8 - 2017/11/08 (水) 11:49:51 - くるりんぱ ご助言ありがとうございます。 接種したのはライノウイルスです。 ウイルス増殖の有無を判定するのに数日置くので、おっしゃるとおり感染後も数日置いている状態です。 単層培養でして、growth mediumで育てているときは96well plateでも、10cm dishでも穴が開かずきれいなシートになってくれます。 そのため、上清を変えたからかな、と考えました。が、原因がなんとも分かりません。 以前他のラボでMDCKを同様の方法で培養しているときはこのようなトラブルはなかったのですが...。 以前との違いは、試薬のロットや使用器具のメーカーなどでして、基本的には同様に行っているつもりです。

(無題) 削除/引用 No.6443-7 - 2017/11/08 (水) 11:38:12 - Tracker 単層培養ですよね。 単層形成後にgrowth mediumで培養し続けても穴はあきませんか？ MDBKではなくMDCKでの経験ですが、シングルクローンにしたら、単層形成後もしばらく飼い続けると穴があいたりするクローンもいました。 ずっときれいな単層で維持されるクローンもいました。 という経験から、単層形成後にも培養を続けて増殖させようとすると剥がれやすくなって穴があく、細胞の性質かなと思っています。 今回はCPEアッセイをされてるとのことなので、感染後も数日培養しているのでは？ 低希釈倍率のウェルでは穴があかないというのは、感染により増殖が止まっているからと解釈できると思います。 なんのウイルスかわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.6443-6 - 2017/11/08 (水) 09:22:31 - くるりんぱ ご助言ありがとうございます。 細胞を洗うときに強めの衝撃がかかっているのでこの影響かもしれません。 教えていただきましたように細胞に対して優しく接するように心掛けます。 あと、思い出したことがあるのですが、自身のミスでたまたま数ウェルの培養液が酸性に傾いてしまいました。pH=4くらいです。 このウェルだけは細胞シートを維持し続けていました。 もしかするとpHが細胞シートに開いた穴と関係するのか？とも思いましたが調べていてもよく分からずです。 何か心あたるかたはいらっしゃらないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6443-5 - 2017/11/08 (水) 07:06:42 - mon 脂質について、正確にいうと脂肪酸です。 リノール酸、α-リノレン酸、レチノイン酸等は生存に必須です。体液中ではアルブミンに結合して運ばれます。 市販されているBSAには、ELISA用などに脂質を取り除いたグレードがあります。 もっとも今回の細胞の状態に関与しているか否かは不明です。 希釈ウィルス液やネガコン培地を添加するときに、水流が強くて剥がれた可能性はありませんか？ 異なる実験ですが、無血清培地では細胞は剥がれやすくなっていますので、私はチップ先端を壁面（のやや上部）に当てるようにして培地を添加しています。

(無題) 削除/引用 No.6443-4 - 2017/11/07 (火) 22:52:56 - くるりんぱ コメントありがとうございます。 グルコースの濃度はDMEMにもともと入れられているグルコース濃度を考えても、浸透圧に問題ない程度かと思います。 BSAですが、脂質のことを存じ上げませんでプロテアーゼフリーのものを購入していました。脂質が混入しているとなにか問題でしたでしょうか。 ウイルスを培養する関係で、血清を培地に入れることを断念してBSAで補填しました。 この組成ですと以前は問題なく細胞シートのままでいてくれていたのですが、今回はなぜか穴が開きます。 脂質がなにか影響しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6443-3 - 2017/11/07 (火) 20:40:17 - mon グルコースを添加していますが、浸透圧は問題ないですか？ 高グルコースDMEMは、浸透圧を調製するため低グルコースDMEMと組成が一部異なります。

(無題) 削除/引用 No.6443-2 - 2017/11/07 (火) 20:37:50 - mon 経験はありませんので参考程度にしてほしいのですが、無血清培地なのが原因で細胞が死んでいるのかもしれません。 BSAはどのグレードを使用していますか。脂質が取り除かれているものでしょうか。 また、DMEM/F12培地が非必須アミノ酸・微量元素・数多くのビタミン類が添加されていて価格も安く、DMEMからの馴化は不要なので便利かもしれません。 さらに生存に必須なITSや liquid concentratesを添加しても良いかもしれません。 Advance DMEM(/F12)培地等はやや高価ですが、添加物が不要かも。

細胞シートに穴が 削除/引用 No.6443-1 - 2017/11/06 (月) 17:26:24 - くるりんぱ こんにちは。 細胞培養時のトラブルについての相談です。 現在、MDBK細胞を使ったウイルス力価の測定を行っています。 方法は96wellプレートを使ったTCID50の算出です。 growth mediumを使って細胞を育てているときはなにも問題なかったのですが、maintenance mediumを使ってプレートでウイルスを培養しているときに問題が発生しました。 ウイルスを加えたところはCPEが起きて、と特に問題なかったのですが、接種ウイルスの希釈倍率が高いウェルやコントロールのウェルの細胞シートに穴が開いて穴がしまいます。もちろん、ウイルスを接種する前はきれいなシートでした。 とくに、培養上清の色はおかしなことはなかったです。 ちなみに、mediumの組成は日水のDMEM+BSA+グルコース+抗生物質（ペニシリン・ストレプトマイシン）+NaHCO3　です。 ウイルスのCPEと識別することはできるので試験自体に特に問題は無いのですが、初めて経験する現象で不安に感じています。 原因に思い当たる節のある方、いらっしゃらないでしょうか。 ご教示、どうぞよろしくお願いいたします。

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