BioTechnicalフォーラム [Tgマウス作製にUTR配列は必要でしょうか]

Tgマウス作製にUTR配列は必要でしょうか

No.6424-TOPIC - 2017/10/28 (土) 22:15:01 - nekokoneko

gene work初心者です。初めて投稿させていただきます。

目的の遺伝子のTgマウスを作るために、遺伝子のクローニングから始めたのですが、その段階でUTR配列を無視して開始コドン~終止コドン(ORF?)でプライマー設計(3'側にタグ付き)、プラスミドへの挿入を行いました。発現確認のためトランスフェクションをしたところタグの発現は確認できました。
しかし、いざTgマウス作成のためにそのORFをTg用のプラスミドに入れたのですが、タンパク発現の効率には5'UTR側(とコザック配列？)が大事、という記述がネットにありました。一方でプロモーターから開始コドンまで長すぎるのは良くないからORFだけでいい、という記述もありまして...どちらが正しいのでしょうか...。

手探り状態でinjectionまでやってしまったのですが、最近ようやくイメージが湧くようになり、焦っています。どうぞ宜しくお願いいたします。
　

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No.6424-12 - 2017/10/30 (月) 17:17:43 - nekokoneko

皆様、

pLckはmonさんのおっしゃるとおり、Lck(Lymphocyte-Specific Protein-Tyrosine Kinase) promotorの入ったプラスミドです。標的組織というか、リンパ球のT細胞で遺伝子を抜く時によく使われています。T細胞系ですので、phoenixなどでは発現してくれない、ということでうちのラボでは発現確認はpMxを使っています。T細胞系列でtransfectionに使えるような細胞株があればいいんですかね...。

pLck(p1017)マップはwebでも検索できるのですが、なぜか肝心のマップのページだけ開いてくれませんでした。

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No.6424-11 - 2017/10/30 (月) 17:07:32 - み

pLcKとやらのプロモーターは何ですか？
Tgマウスで発現させたい標的組織でそのプロモーターは有意に機能するのかな。

(無題)

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No.6424-10 - 2017/10/30 (月) 12:22:20 - mon

pLCK vectorは、Lymphocyte Cell-Specific Protein-Tyrosine Kinase promoterを使っているものでしょうか。
そうであると、HEK293細胞等ではほとんど発現しないと思います。

(無題)

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No.6424-9 - 2017/10/30 (月) 11:12:28 - おお

ふつうはプラスミドがちがうからトランスフェクションができないとかないと思います。

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No.6424-8 - 2017/10/30 (月) 11:11:12 - おお

pLckのマップとかみれますか？

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No.6424-7 - 2017/10/30 (月) 11:04:11 - nekokoneko

monさん、おおさん

ご回答ありがとうございます。
そうですね、私も素人ながらTg用とは別のベクターではあまり意味がないのでは...などと思っていました。
ただ、(出しても問題ないと思うので出しますが)Tg用のベクターはpLckで、現在うちのラボではそのベクターのままトランスフェクションをする手技が確立しておりません。だいたいみんなpMxにのせかえて発現チェックをしています。クローニングした遺伝子がちゃんとした配列か、タンパクで発現しうるか、程度の確認となっています。
pLckのままでもエレクトロポレーションなどで入れられるんでしょうか...？

(無題)

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No.6424-6 - 2017/10/29 (日) 07:15:01 - おお

Tg用のベクターで発現をチェックすると解決するだろうなと私も思います。5'UTR側はコザック配列をつけたほうが安心というのはあります。なので典型的なコザックをMのところに導入して発現ベクターを作ることはよくやられています。あるいはcDNAの５’UTRのコザックとして機能する部分を残しておく場合もあるでしょう。個人的には１０bもあれば十分と思ってます。あまり長いとその他の発現調節に関与する配列が含まれる可能性が否定できなくなるので。

(無題)

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No.6424-5 - 2017/10/29 (日) 01:38:33 - み

>[Re:4] nekokonekoさんは書きました :
> (別ベクターですが)トランスフェクションで発現確認ができたということは、この遺伝子ではなくても大丈夫、ということでしょうか。

ベクターを移行したのだからおそらく1st メチオニンの前の配列が違うものになってますよね。Tg用のベクターでも発現チェックしとかないと何とも言えません。

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No.6424-4 - 2017/10/28 (土) 23:29:49 - nekokoneko

monさん

さっそくご回答いただきありがとうございます。
そうなんですね...少し安心してきました。
(別ベクターですが)トランスフェクションで発現確認ができたということは、この遺伝子ではなくても大丈夫、ということでしょうか。

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No.6424-3 - 2017/10/28 (土) 23:26:54 - nekokoneko

追記です。

Tg用のplasmidは供与していただいたのですが、その時もらった情報の中に
「removed 149bp of 5'UT containing 3 AUG」
「contains 37 bp of 5'UT」
と書いてありました(字が汚くて正確でないかもしれないのですが...)。
ここに翻訳開始のための配列も入っている、ということなのでしょうか。

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No.6424-2 - 2017/10/28 (土) 23:24:09 - mon

kozak配列は翻訳（開始）効率を１～数倍あげますが必須ではありません。
５'UTRが発現向上に有効か否かは遺伝子によります。場合によっては抑制的な配列もあります。（汎用されている）発現ベクターに入れる場合は５'UTRは必要無いです。

Tgマウス作製にUTR配列は必要でしょうか

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No.6424-1 - 2017/10/28 (土) 22:15:01 - nekokoneko

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