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fireflyがRenilaに干渉します。 トピック削除
No.6423-TOPIC - 2017/10/27 (金) 19:42:43 - 愛
同じようなトピがありましたが、解決できませんでしたのでトピックを立てされせていただきました。よろしくお願いいたします。

pGL3に1kbほどのある遺伝子のエンハンサーをクローニングしました。これをAとします。
エンハンサーはとある転写因子Bにより直接的もしくは間接的に活性化し、firefly luc.の発現を高めます。また、その転写因子の結合サイトに変異を与えたものも作製し、firefly luc.の発現をバックグラウンドまで抑える事ができました。これをCとします。WTのエンハンサーはHeLa細胞では全くアクティブではなく、転写因子との共発現の時にのみアクティブになります。

ただ以上のことは実はRenillaで補正しなかった場合のことです。そしてどうもRenillaがfireflyで干渉しているようです。RenillaをDとします。ちなみにDとは、pRL-TKです。


どうも、A. B . Dを入れたサンプルを解析する際、敢えてfireflyの気質を加えず、Renilla基質だけを加えると、Renilla luc.は2000ほどです。ところが、firefly基質を加えて、Renilla基質を加えると、Renilla luc.は20000から30000ほどに跳ね上がります。

リーダーはプロメガのルミノメーターです。
プログラムはDUL-0-INJです。

使用するプログラムが間違っているのでしょうか。
大変初歩的な質問で申し訳ありませんが、ご教示頂けますと嬉しいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.6423-4 - 2017/10/28 (土) 01:21:17 - 774
Dualのキットでfirefly基質を加えずにrenilla基質だけ加えても全く値が出なかった気がします。
Lysis buffer＋基質1,2で測定した場合、renillaは2000くらいなのでは？
一度、renilla lucだけをトランスフェクションしたサンプルで測定すればハッキリすると思います。

firefly測定時にサンプルが飛び散ってて、
renilla基質加えてもfireflyのを消光できずにrenillaに加算されてしまう可能性も。
インジェクター使ってるっぽいので、大丈夫そうですが。

(無題) 削除/引用
No.6423-3 - 2017/10/27 (金) 23:49:54 - 愛
mon様、ありがとうございます。

はい、”Detect firefly and Renilla Luciferase Activities in a Single Sample”というプロメガの試薬を使っています。Renilla基質にはfirefly luc.を抑える働きがあるとのことで購入しています。

https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_luciferase-reporter-assay-system/?catNum=E1910

ただ、試薬を節約するために、

ライセート20マイクロL
＋firefly 60マイクロL
＋Renilla 60マイクロL

という割合で使っています。
確かにおっしゃられるように、firefly luc.を抑えきれていないのかもしれません。。

>[Re:2] monさんは書きました :
> Dual Luciferaseの試薬キットに含まれるRenilla基質（＋buffer)は、firefly luc.を抑える組成になっています。
> ご使用のRenilla基質はそのようになっていますか。

(無題) 削除/引用
No.6423-2 - 2017/10/27 (金) 20:55:50 - mon
Dual Luciferaseの試薬キットに含まれるRenilla基質（＋buffer)は、firefly luc.を抑える組成になっています。
ご使用のRenilla基質はそのようになっていますか。

fireflyがRenilaに干渉します。 削除/引用
No.6423-1 - 2017/10/27 (金) 19:42:43 - 愛
同じようなトピがありましたが、解決できませんでしたのでトピックを立てされせていただきました。よろしくお願いいたします。

pGL3に1kbほどのある遺伝子のエンハンサーをクローニングしました。これをAとします。
エンハンサーはとある転写因子Bにより直接的もしくは間接的に活性化し、firefly luc.の発現を高めます。また、その転写因子の結合サイトに変異を与えたものも作製し、firefly luc.の発現をバックグラウンドまで抑える事ができました。これをCとします。WTのエンハンサーはHeLa細胞では全くアクティブではなく、転写因子との共発現の時にのみアクティブになります。

ただ以上のことは実はRenillaで補正しなかった場合のことです。そしてどうもRenillaがfireflyで干渉しているようです。RenillaをDとします。ちなみにDとは、pRL-TKです。


どうも、A. B . Dを入れたサンプルを解析する際、敢えてfireflyの気質を加えず、Renilla基質だけを加えると、Renilla luc.は2000ほどです。ところが、firefly基質を加えて、Renilla基質を加えると、Renilla luc.は20000から30000ほどに跳ね上がります。

リーダーはプロメガのルミノメーターです。
プログラムはDUL-0-INJです。

使用するプログラムが間違っているのでしょうか。
大変初歩的な質問で申し訳ありませんが、ご教示頂けますと嬉しいです。
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