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SDS-PAGEでの問題 トピック削除
No.642-TOPIC - 2012/06/18 (月) 10:45:12 - わんこ
複合体を精製して、SDS-PAGEで確認したところ、サブユニットのうち一番高分子量のサブユニット(170 kDa)だけがスメアとなり、バンドがほとんど見えないといった状況になりました。

そこで、アクリルアミド、Buffer等、全て作り直し、なおかつ、サンプルが上手く精製出来ていないだけの可能性もあるので、以前に精製したものできちんと精製されていることがわかっているサンプル(sample bufferは、新しく調製して添加したもの)を用いて、更に他の人が使っているアクリルアミドやBufferも借りて比較したりもしたのですが、一向に改善されません。

他のサブユニット(120〜40 kDa)は全てはっきりとバンドが検出されており、一切乱れていません。

複合体ですし、過去に何度もそのタンパクを扱っていますが、そのようなことになったことがないので、そのサブユニットだけが分解されたとは思えず、何を直せばいいのか分からなくなっています。

お心当たりがございましたら、ぜひ、ご教授いただけないでしょうか?
 
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(無題) 削除/引用
No.642-14 - 2012/06/19 (火) 08:52:42 - 直輝
サンプルのロード量を減らした時に、それまでは単一バンドだと思っていたものが、薄いバンドだとラダー状に見えてきたこともありますよ。

糖鎖修飾のバリエーションかなぁと解釈してますが。

(無題) 削除/引用
No.642-13 - 2012/06/19 (火) 08:41:25 - gelman
私も、うさんのような印象がありますが、サンプル自体の処理についてはどうされてますか?たとえば、溶液をそのままSDSとDTTで加熱したものなのか、濃縮のために沈殿して処理したものか、などは?スネアになるというのは均一なSDS-タンパク複合体になっていないということなので、サンプル処理関係のように思います。

(無題) 削除/引用
No.642-12 - 2012/06/19 (火) 08:40:31 - 直輝
サンプルバッファーが悪くて、スメアになった経験はあります。
凍結融解でスメアになったこともあります。

(無題) 削除/引用
No.642-10 - 2012/06/19 (火) 08:26:10 - う
その目的のタンパク質だけ、そういう風になる特性がある、
ということではないかと。
これは否定されているみたいですが、まぁ聞いて下さい。

何回も行なってクリアなバンドが検出とありますが、
本当に、同じサンプル(ひとつのチューブ中)を
何回も泳動してクリアなバンドが検出したのでしょうか?

私の経験では、
一度綺麗なバンドが検出できたサンプルだから、
二度目以降もきちんとなるはず、とは限らない場合もある、
ということもありました。

特に、大きなタンパク質である時に見られたことで、
数回冷凍からサンプルを泳動する前に煮てをやった場合、
いくらサンプルバッファー中であっても、
タンパク質が「アグる」とでもいいますか、
ラダー状、もしくはスメアっぽくなったことがあります。
また、初回の泳動であっても、どういう具合かわかりませんが、
時に、初回であっても、スメアっぽくなることもありました。
その場合、加熱を加減したりしましたが、あまりコントロールできませんでした。

解決策にはなりませんが、参考までに。

(無題) 削除/引用
No.642-9 - 2012/06/18 (月) 17:47:05 - ~
まずは、そのタンパク質固有の問題なのか、そのサイズのタンパク質全般の問題なのかを切り分けるのが最初の一歩かと思います。

分子量マーカーは170kDよりも大きいサイズのバンドがあり、それはこれまで通りに分離しているのでしょうか?
そのサイズのマーカーが適切に分離されているのであれば、タンパク質自身の問題にフォーカスできるでしょうし、
そのマーカーのバンドも分離していない又は170kD以上のサイズのないマーカーを使っているのであれば、ゲル側の問題が残るでしょう。

他の人は、そのくらいの高分子量のタンパク質を分離しているのでしょうか?
していないのであれば、高分子量の分離に使える試薬であるかどうかは確認できていないでしょう。


また、TEMEDは駄目になるのが早い試薬だと思います。
ゲルが原因の可能性が捨てきれないのであれば、買い直してみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.642-8 - 2012/06/18 (月) 17:36:39 - ROM専
電気泳動が原因であるとすると、濃縮ゲル濃度が適切でない場合、まれにみられますよ。濃縮されずに分離ゲルに入っていった場合問題が起こりやすいです。特に、プレキャストゲル等ではなく、濃縮ゲルと分離ゲルの境界がキッチリ分かれている自作ゲルの場合は。

何パーセントの濃縮ゲルを使ってますか?170kDaは4〜5パーセントではうまく濃縮されないとおもいます。確実なのは3パーセント程度でしょうか。

(無題) 削除/引用
No.642-7 - 2012/06/18 (月) 15:26:44 - わんこ
書き方が悪かったのか、伝わっていないようなのでまとめてみます

1.今回、スメアになったタンパク質が問題なく単一バンドとして検出されることはわかっている(何十回と今まで行ってきたが、こういうことになったのは初めて)

2.新たに精製した(うまく精製できているかわからない)サンプルだけでなく、過去に精製してCBB染色でクリアーなバンドが検出されているサンプルを使用してもスメアになる

3.スメアになるのは複合体の内の一番高分子量のタンパクのみであり、同時発現・精製した他のサブユニットはクリアーにバンドとして検出されている

4.試薬を作り直し、また、自分のミスである可能性を考え、他の人が使用している試薬でも行ったが、結果は同じである

5.昔とは、精製水、Bis、Tris、SDSなどのものが違う

6.他のサブユニットなどは問題ないことを考えると、現在使用している試薬に問題があったとしても、他の人には影響がないだけの可能性もある(そのスメアになったタンパクは私しか用いてないので)

といったところです

(無題) 削除/引用
No.642-6 - 2012/06/18 (月) 15:14:56 - わんこ
泳動を何回もしたことがあり、スメアにならないことを確かめてあるサンプルです。

そのタンパクに関しては今までずっとやっているので、タンパクの性質が原因でないことは確かなのです。

ただ、今回の精製サンプルだけではサンプルが分解されている可能性もあったので、念を押して以前に精製して泳動したことのあるサンプル(‐80℃でストックしてあったもの)で確認したわけです。

それでも、今までスメアにならなかったタンパクがスメアになってしまうので、困っている次第です。

ですので、ある試薬を変更したら一部だけ乱れたことがあるとかそういった情報はないかと思い、質問しております。

(無題) 削除/引用
No.642-5 - 2012/06/18 (月) 14:33:43 - Q
>以前に精製したものできちんと精製されていることがわかっているサンプル(sample bufferは、新しく調製して添加したもの)を用いて、更に他の人が使っているアクリルアミドやBufferも借りて比較したりもしたのですが、一向に改善されません。

禅問答をしているようでなんですが、以前に精製されていることがわかっているとは
泳動してスメアでないことは確かめられているのでしょうか?
(多分、確認していないのでしょうけど)

改善されるはず、という絶対的な自信に違和感を覚えるのは私だけではないように思えます。
さも泳動が何か問題があると決めつけている感じを受けますが、SDS-PAGEの特性を考えていただければ、そのタンパク質の性質からそういうこともあるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.642-4 - 2012/06/18 (月) 14:10:32 - gelman
そのスメアになっている170Kのバンドが、シャープな単一バンドとしてSDS-PAGEで見えたことはあるのですか?

(無題) 削除/引用
No.642-3 - 2012/06/18 (月) 12:08:05 - わんこ
もちろん、分子量マーカーも、同時発現して精製した他のサブユニットも問題なく通常出てくるであろうあたりの位置に見えており、そのサブユニットのバンドだけが乱れるのです。

ゲルのパーセントが違う場合は、全体的に違う挙動を示すでしょうし、そういった状況ではございません。

アクリルアミドかメルカプトエタノールかSDSかpHのズレかなと考えたのですが、試薬を作り直しても他の人が使用している試薬を使ってもそうなったので、どうしたものかと悩んでいるところです。

しかも、今までそういうこと(特定のものだけが乱れること)がなかったもので

(無題) 削除/引用
No.642-2 - 2012/06/18 (月) 11:50:29 - ~
単にゲルの濃度が適切でないだけでも、そのような現象は見られると思います。
分子量マーカーは分離できているのですか?

SDS-PAGEでの問題 削除/引用
No.642-1 - 2012/06/18 (月) 10:45:12 - わんこ
複合体を精製して、SDS-PAGEで確認したところ、サブユニットのうち一番高分子量のサブユニット(170 kDa)だけがスメアとなり、バンドがほとんど見えないといった状況になりました。

そこで、アクリルアミド、Buffer等、全て作り直し、なおかつ、サンプルが上手く精製出来ていないだけの可能性もあるので、以前に精製したものできちんと精製されていることがわかっているサンプル(sample bufferは、新しく調製して添加したもの)を用いて、更に他の人が使っているアクリルアミドやBufferも借りて比較したりもしたのですが、一向に改善されません。

他のサブユニット(120〜40 kDa)は全てはっきりとバンドが検出されており、一切乱れていません。

複合体ですし、過去に何度もそのタンパクを扱っていますが、そのようなことになったことがないので、そのサブユニットだけが分解されたとは思えず、何を直せばいいのか分からなくなっています。

お心当たりがございましたら、ぜひ、ご教授いただけないでしょうか?

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