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(無題) 削除/引用 No.6411-4 - 2017/10/25 (水) 08:58:38 - HKHL おおさん、monさん、どうもありがとうございます。 転写産物を逆転写しています。あ、コントロールとしてendogenousのRNAを見ることもありますが、全てHEKではバンドが現れません。 トランスフェクションは、GFPの蛍光を見る限り、むしろHEKの方がよく導入されているぐらいです。 複数の異なる遺伝子を持つプラスミドで、何度行っても再現よくHEKからはバンドが見られません。RNAのクオリティーは、電気泳動でrRNAを見たこともありますが問題ないです。ただし毎度泳動まではしておらず、もっぱらNanodropの波長のみです。これも特に問題はないと思うのですが…。 Total cell lysateを見たりWesternなんかの結果を見ても、HEK由来のものはHeLaより汚い印象があるため、monさんのおっしゃるように（グアニジンに限らず）何らかの良くないものが残存しているのかもしれないですね。一応フェノクロを繰り返したりもしたのですが、さらにもう何ステップか精製をしてみようかと思います。良からぬもののせいで既にRNAが分解されていたとしたら、全く無意味な工程になってしまうかもしれませんが…。

(無題) 削除/引用 No.6411-3 - 2017/10/25 (水) 07:41:15 - mon TRIzolの成分のグアニジンが残留しているのでは？ ネット・Manual等に対処法が載っていると思います。

(無題) 削除/引用 No.6411-2 - 2017/10/25 (水) 04:16:13 - おお 両方扱ったことはありますが、特にどちらかに特徴的なことはあまりなかったと思います。 primer extensionはトランスフェクションしたプラスミドの転写産物ですか？だとしたらTransfectionはどの程度うまく行ってますか？ 一度だけの実験ですか？何回か繰り返しましたか？ RNAのクオリティーの評価はどのようにやってますか？

HeLaとHEK293からのトータルRNA 削除/引用 No.6411-1 - 2017/10/25 (水) 01:21:13 - HKHL HeLaとHEK293で同じようにトランスフェクションを行い（コントロールのGFPは同じように蛍光観察されています）、同じようにTRIzolでトータルRNAの抽出を行ったのですが、逆転写（放射性ラベルを用いたprimer extension）を行った所、HeLaからはキレイなバンドが得られるものの、HEK293からは、色々なプラスミドのトランスフェクションサンプルを用いているのですが、全く逆転写産物が検出されません。 何かHEK293から取ったRNAで気をつける点というのは、これといって特にありますでしょうか？基本的に全てHeLaと同じようにやっているのに、HEKの方が一切ワークしないのが非常に不思議です…

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