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(無題) 削除/引用 No.6389-16 - 2017/10/18 (水) 23:00:33 - 畳とプラスミドは若い方が良い > オリジナルのほうが古くて変異体のほうが新しいとすると、古いほうが活性が出てるってことですよね。。。まあ精製した日付は本人にしかわからないでしょうけど、、、 いやあ、仰るとおり私の書いたことは穴だらけの話ではあるのですが、以前は100~1000倍、今回は10倍程度と幅があるので、とりあえずの可能性として書いてみようかと。 >長期保存するなら凍結すると思いますしそうすればまず大丈夫だと私は思ってますけど。 古いプラスミドだと発現が下がる、はこの掲示板でも言っている人がいたように思っていましたが、おおさんではなくどなたか別の方ですね。 凍結融解の影響の方が怖いから4Cで保存するように、と指導しているところもあるようだし、その場合は保存期間によって影響が出るだろうし（私はそのケースでした）。 マキシで作って一本のチューブにいれて-20C （ないし-80C）で保存、使うたびに融かす、をやっていたら凍結融解の回数が20回とかを超えていき、やはり発現に影響が出た（最初は気づかなかったけど、後になったら目に見えて低下していた）、という話を聞いたこともあります。トピ主さんがどのようにプラスミドを保存していたかもわからないので、これも書いておこうかと。

(無題) 削除/引用 No.6389-15 - 2017/10/18 (水) 10:37:25 - おお >オリジナルのプラスミドを元に変異体を作ったとありますが、作成期間のずれはどれ位ですか？ オリジナルのほうが古くて変異体のほうが新しいとすると、古いほうが活性が出てるってことですよね。。。まあ精製した日付は本人にしかわからないでしょうけど、、、長期保存するなら凍結すると思いますしそうすればまず大丈夫だと私は思ってますけど。

(無題) 削除/引用 No.6389-14 - 2017/10/18 (水) 02:55:40 - 畳とプラスミドは若い方が良い とりあえず、 1）>キアゲンのミディプレップキット これで精製したプラスミドで、エンドトキシンが問題になることは余り無いような…。自分だけ？ 2）レニラ補正無しのデータが、以前は100-1000倍、今回は10倍程度とのこと。レポーターアッセイの数値は確かにぶれるもんだけど、50~100倍ずれてるようだちょっとなあ（自分が指導教官だったらそれで論文にはさせません）。日をずらして数回やってみても、最近は以前に比べてそれ位低くなってしまうのでしょうか？また、それぞれで値は大体同じになっていますか？ 3）先行研究もトピ主さんと同じ細胞での（たかだか3%の導入効率での）報告なんでしょうか？ 4）「普通に転写因子Xの過剰発現を行うと遺伝子Yは100倍ほど増加するので、間違いなく先行研究は再現できるはずなんです。」これはトピ主さんが実際にやった実験ですか？であれば、どの細胞で？100倍というのはqPCRの結果？それと、転写因子Xの過剰発現はどのように行ったのでしょうか？これもトランスフェクション？ 5）オリジナルのプラスミドを元に変異体を作ったとありますが、作成期間のずれはどれ位ですか？プラスミドが古くなると（濃度や260/280の比が極端に変わったりせずとも）なぜか発現率が変わることがあります。私は半年ずれた作成期間でプラスミドをつくり、最初の実験では自分にとって好ましいデータが出たのが、確認のためと実験のスケールアップとに必要になって全プラスミドを同時に作成してからリピートしたら差がなくなってしまい困惑したことがあります。最終的に、同じプラスミドでも、半年前に作ったものとフレッシュなものでは発現量にかなりの差（WBでおおよそ3倍とか）が出ることがあることを確認できました。以来、発現量を比較するような実験に使うプラスミドは必ず同時期（というか、フレッシュなもの）に作ったものを使うようにしています。

(無題) 削除/引用 No.6389-12 - 2017/10/17 (火) 12:31:13 - おお あと、1％トリトンX100はおそらく大丈夫だと思いますが（特にホタルの方は）、プロメガのLysis bufferに多分０．１％位入っているんだと思います。細胞膜が破壊されればいいくらいの量あればいいので、目で見て明らかにデブリみたいなのがあっても遠心して上清を使えばおそらく問題がないのだと思いますけど、、、どうしても気になるなら、Lysis buffer添加後、ごく一部とって顕微鏡で細胞が壊れているか確認するてもあります。昔はHypotonic bufferなどを使い、Freeze-thawを３回ほど行い細胞を壊して活性を測っていたようです。プロメガLysis bufferを加えて一度Freeze-thawしてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6389-11 - 2017/10/17 (火) 12:22:52 - おお >飽和尿素の方法について興味がありますので、詳しく教えていただけますか？ あまり何も考えないで４００mMのNaClを用意して、尿素を溶液の体積の２分の３ぐらい加えてボルテックスを時たましながら室温で放置しています。尿素が完全に溶けないようなら飽和していると考えてそれをDNA溶液に等量加えています（尿素がとけると容積は増えるので４００mMとはいいがたいですけど）。ストックは作っていません（蛋白ではCarbamylatoin を避けるため毎回要事調製なので、DNAに対してどこまで影響するかわかりませんけど）。 飽和尿素、DNA溶液の混液の量に対して等量のイソプロピルアルコール（１００％）か２倍量のエタノール（１００％）を加え、遠心してDNAを沈殿させます。７０％アルコールを加え転倒混和し再度遠心、DNAを風乾して適量のTEか水を加えればいいです。

(無題) 削除/引用 No.6389-10 - 2017/10/17 (火) 12:06:26 - おお >はい、すでに行なっています。 >WTレポータ、または4つのその変異体と、レニラを導入した場合には、どちらの値も低いままです。（コントロールベクターとして、ベクターバックボーンは違うのですが、pEGFP-N1を使用しました。） いろいろなプラスミドを混ぜると何が影響しているのか見出しにくいので、pEGFP-N1を使わずもっとシンプルな系にしたらどうかと申し上げています。

(無題) 削除/引用 No.6389-9 - 2017/10/17 (火) 12:04:20 - レポーター実験 おおさん、 特別、エンドトキシンを除去できるものとは歌っていません。 飽和尿素の方法について興味がありますので、詳しく教えていただけますか？ 尿素の水への溶解度は107.9 g/100 ml (20 °C)となるようてす。 この溶液をまず作り、その後に400mMになるよう塩を秤量し、加えたものをストック溶液として作り、同量のプラスミド溶液in TEと混和後にそこへ、100%エタノールを加えて４度、マックスで遠心した後、上映を捨て、さらに70%エタノールで軽く洗ったものを再度、TEで希釈する手順で大丈夫でしょうか？ 収量とかいかがでしょうか。また、待つ時間を設けた方がいいでしょうか？ 詳しく教えていただけると大変嬉しいです。すみません。宜しくお願い致します。 >[Re:8] おおさんは書きました : > >プラスミド精製はキアゲンのミディプレップキットを使用しています。 > ナノドロップで260/280も1.95くらいです。 > > エンドトキシンが除去できるタイプですか？そうでなければ、自身でさらに精製してみるといいかも。Tritonx114を使う方法が出回っています。検索すればいくらか出てくるでしょう。もしTritonx114が手元にないなら４００mMNaClの飽和ウレア溶液をつくり、DNA溶液に対して等量加えてエタ沈すると、いいかと思います。後者の方法は手前味噌なのでしっかりとした Charactorizationは見つからないというか、してませんけど、毒性が現れたりするプラスミド（精製はテクニシャンがきっと使わずしているのでけこう汚い）がかなり改善されます。

(無題) 削除/引用 No.6389-8 - 2017/10/17 (火) 11:17:40 - おお >プラスミド精製はキアゲンのミディプレップキットを使用しています。 ナノドロップで260/280も1.95くらいです。 エンドトキシンが除去できるタイプですか？そうでなければ、自身でさらに精製してみるといいかも。Tritonx114を使う方法が出回っています。検索すればいくらか出てくるでしょう。もしTritonx114が手元にないなら４００mMNaClの飽和ウレア溶液をつくり、DNA溶液に対して等量加えてエタ沈すると、いいかと思います。後者の方法は手前味噌なのでしっかりとした Charactorizationは見つからないというか、してませんけど、毒性が現れたりするプラスミド（精製はテクニシャンがきっと使わずしているのでけこう汚い）がかなり改善されます。

(無題) 削除/引用 No.6389-7 - 2017/10/17 (火) 06:16:31 - レポータ実験 おおさん、 ありがとうございます。 転写因子X無しの挙動は、全くどちらの値も低いままです。 > まずレポーターの変異体とレニラだけで確認すべきと思います。いろいろとベクターを入れると転写因子の競合とか干渉とか影響を受ける可能性がありますので。 はい、すでに行なっています。 WTレポータ、または4つのその変異体と、レニラを導入した場合には、どちらの値も低いままです。（コントロールベクターとして、ベクターバックボーンは違うのですが、pEGFP-N1を使用しました。） 転写因子Xを入れた時にのみ、WTレポータのfireflyおよびRenillaの発光が極端に高くなります。 つまり、 1）WT fireflyレポータ　　+Renillaレポータ　＝　firefly値：Renilla値 ＝250 : 250 2）変異体fireflyレポータ　+Renillaレポータ　＝　firefly値：Renilla値 = 250 : 250 3）WT fireflyレポータ　　+Renillaレポータ　+転写因子X　＝　firefly値：Renilla値 ＝10000 : 10000 4）変異体fireflyレポータ　+Renillaレポータ　+転写因子X　＝　firefly値：Renilla値 = 250 : 250 このようなデータです。レニラがブレすぎますよね…。 > プラスミドの精製に伴う混入物も気になるところです。たとえば変異してないレポーターを変異しているレポーターに混ぜてトランスフェクションすると、プラスミドに含まれる夾雑物の影響がある程度推測できます。プラスミド精製はどのように行ってますか？ プラスミド精製はキアゲンのミディプレップキットを使用しています。 ナノドロップで260/280も1.95くらいです。 そうですね、WTと一緒に変異プラスミドも導入してやってみます。 ありがとうございます。 GFPの導入効率は1つのウェルでしか行なっていませんでしたので、次回すべてのウェルに加えて行なってみます。 ちなみに、遺伝子導入試薬はPEImaxを使用していますが、きちんとすべてのDNAコンポーネントは一緒くたになって細胞に入っているのでしょうか？イメージとしてはカチオニックリポソームのようなものはすべてパッケージするイメージですが、PEImaxだとどうなんでしょうか。 >[Re:4] おおさんは書きました : > > 転写因子Xあるなしでの挙動はどうでしょうか。 > > まずレポーターの変異体とレニラだけで確認すべきと思います。いろいろとベクターを入れると転写因子の競合とか干渉とか影響を受ける可能性がありますので。 > > プラスミドの精製に伴う混入物も気になるところです。たとえば変異してないレポーターを変異しているレポーターに混ぜてトランスフェクションすると、プラスミドに含まれる夾雑物の影響がある程度推測できます。プラスミド精製はどのように行ってますか？ > > どうも不死化線維芽細胞で３％ぐらいというのが気になります。 > > 今回のEGFPの発現効率は各サンプル間で一定してますか？

(無題) 削除/引用 No.6389-6 - 2017/10/17 (火) 06:04:01 - レポータ実験 monさん ありがとうございます。 1の遺伝子導入効率だとすれば、データの解釈が変わって来ますね…。 すでに、転写因子Xが私のルシフェラーゼレポーターYを活性化するという報告が他のグループから出ているんです。 今回のデータからレニラのデータを一切無視し、fireflyの値だけを読むと理にかなったデータになっています。 まるでfireflyの発光がRenillaの検出窓に漏れ混んでいるかのような、綺麗な正比例の相関が得られるんです。 ただ、Trackerさんやmonさんが言われるように、遺伝子導入効率が変異プラスミドを導入した際に落ちるようなことがあるならば（LPSなどの混入？）、やはりRenillaで補正した値が正しいことになり、そうなるとこれまでの報告が再現できないことになります。ただ、ルシフェラーゼアッセイではなく、普通に転写因子Xの過剰発現を行うと遺伝子Yは100倍ほど増加するので、間違いなく先行研究は再現できるはずなんです。エンハンサー領域は報告されたものを使っています。 > (2)の場合は、Renilla Luciferaseベクターを最新のpGL4.74[hRluc/TK]に変更する、混合率を1/50-1/100にする（あるいは1/10に増やす）と改善することがあります。 pRL-TKを使っています。 fireflyレポータを1とすると、質量比でRenillaレポータは0.4使っています。プレリミの結果この比率にしましたが、monのコメントでは最大でも1：0.1までにすべきということですね。 私の場合はそれより4倍多いものでした。 > それでも変動する場合があります(transactivation)。その場合は、SD付きのグラフを3種（ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、補正したもの）を用意して、目的プロモーター配列(に結合するタンパク）がレニラルシフェラーゼベクターにも影響すると言えばよいと思います。 > GFP陽性率による補正について、GFPの発現も影響を受けている可能性（カットオフ値によっては陽性率が変化する可能性）もあるので、注意しながら（GFP陽性率による補正した）データを追加しても良いと思います。 Renillaレポータが250から5000までブレ、その値はfireflyレポータの値に綺麗に相関しているので、fireflyの値がRenillaに干渉していることは間違いなさそうです。 そうですね。まずいただいたコメントを精査しながらベストを探ってみます。 >[Re:3] monさんは書きました : > Renilla Luciferaseの値が変動する理由は、(1)遺伝子導入効率（2）何かしらの（転写）因子がRenilla Luciferase promoterに影響した、等です。これにはRenilla Luciferase遺伝子配列に結合する転写因子の可能性もあります（刺激・細胞種やによって変わる可能あり）。 > (1)の場合は、何度か実験しRenilla Luciferaseの値の値が「ある桁」内で安定していれば問題ないと言えます(2~5倍程度は普通に変動する）。 > (2)の場合は、Renilla Luciferaseベクターを最新のpGL4.74[hRluc/TK]に変更する、混合率を1/50-1/100にする（あるいは1/10に増やす）と改善することがあります。 > それでも変動する場合があります(transactivation)。その場合は、SD付きのグラフを3種（ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、補正したもの）を用意して、目的プロモーター配列(に結合するタンパク）がレニラルシフェラーゼベクターにも影響すると言えばよいと思います。 > GFP陽性率による補正について、GFPの発現も影響を受けている可能性（カットオフ値によっては陽性率が変化する可能性）もあるので、注意しながら（GFP陽性率による補正した）データを追加しても良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6389-5 - 2017/10/17 (火) 05:50:16 - レポータ実験 Trackerさん ありがとうございます。 オリジナルのプラスミドを元に、変異体5つをその後に作ったので、プラスミドを精製した日は違っていますが、ナノドロップで測定した結果、濃度も予想されたもので、260/280も1.95ほどでした。 GFPに関しては1つのウェルしかやっていませんでした。GFPのみを導入したものです。 おおよその導入効率を見たくて行いました。 プラスミドの精製は、キアゲンのミディプレップキットを用いています。 >[Re:2] Trackerさんは書きました : > オリジナルのプラスミドと変異型のプラスミド5種は同様の方法で精製され、同じグレードの純度ですか？ > GFPで見た導入効率では、プラスミド間、レプリケート間でどのからいバラツキが出ますか？

(無題) 削除/引用 No.6389-4 - 2017/10/17 (火) 03:43:06 - おお 転写因子Xあるなしでの挙動はどうでしょうか。 まずレポーターの変異体とレニラだけで確認すべきと思います。いろいろとベクターを入れると転写因子の競合とか干渉とか影響を受ける可能性がありますので。 プラスミドの精製に伴う混入物も気になるところです。たとえば変異してないレポーターを変異しているレポーターに混ぜてトランスフェクションすると、プラスミドに含まれる夾雑物の影響がある程度推測できます。プラスミド精製はどのように行ってますか？ どうも不死化線維芽細胞で３％ぐらいというのが気になります。 今回のEGFPの発現効率は各サンプル間で一定してますか？

(無題) 削除/引用 No.6389-3 - 2017/10/16 (月) 20:37:17 - mon Renilla Luciferaseの値が変動する理由は、(1)遺伝子導入効率（2）何かしらの（転写）因子がRenilla Luciferase promoterに影響した、等です。これにはRenilla Luciferase遺伝子配列に結合する転写因子の可能性もあります（刺激・細胞種やによって変わる可能あり）。 (1)の場合は、何度か実験しRenilla Luciferaseの値の値が「ある桁」内で安定していれば問題ないと言えます(2~5倍程度は普通に変動する）。 (2)の場合は、Renilla Luciferaseベクターを最新のpGL4.74[hRluc/TK]に変更する、混合率を1/50-1/100にする（あるいは1/10に増やす）と改善することがあります。 それでも変動する場合があります(transactivation)。その場合は、SD付きのグラフを3種（ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、補正したもの）を用意して、目的プロモーター配列(に結合するタンパク）がレニラルシフェラーゼベクターにも影響すると言えばよいと思います。 GFP陽性率による補正について、GFPの発現も影響を受けている可能性（カットオフ値によっては陽性率が変化する可能性）もあるので、注意しながら（GFP陽性率による補正した）データを追加しても良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6389-2 - 2017/10/16 (月) 12:46:28 - Tracker オリジナルのプラスミドと変異型のプラスミド5種は同様の方法で精製され、同じグレードの純度ですか？ GFPで見た導入効率では、プラスミド間、レプリケート間でどのからいバラツキが出ますか？

ルシフェラーゼ実験に関して。 削除/引用 No.6389-1 - 2017/10/16 (月) 01:47:47 - レポータ実験 約ひと月前に、トランスフェクション効率が低い細胞でのルシフェラーゼ実験についてご相談させていただきました。hTERTにて不死化させたヒト線維芽細胞ですが、やはりどうあがいても3％ほどの導入効率でした。その折はありがとうございました。 ルシフェラーゼ実験は初めてで、当初レニラで補正せず、すべてのウェルで導入効率は同じであろうと仮定して、予備実験を行いました。5つの変異体を含む、合計6つのルシフェラーゼプラスミドを作製しました。 オリジナルのルシフェラーゼコンストラクトでは高い活性（100-1000倍）が認められ、残り5つの変異体では活性が非常に低いものでした。この時、別の1つのウェルにGFPをトランスフェクションしており、それをFACSにて解析し、導入効率を算出していました。 いよいよ論文用のデータを取得するべく、また、全ウェルをレニラで補正すべきであると気づき、ルシフェラーゼレポータ、レニラ、そしてＥＧＦＰコントロールもしくは転写因子Xの合計3つを導入しました。 すべてデュプリケートで行なっており、ルミノメータにてデュアルのルシフェラーゼ活性を評価しました。 すると、ファイアフライルシフェラーゼの方は、以前同様、オリジナルのプラスミドで高く（意外なことに10倍程度）、残りの5つの変異体では低い値をしめしていました。なぜ以前とこれほどの差が生じてしまうのかわかりませんが、まずはレニラで補正したところ、補正値では6つのプラスミドで差が認められなくなりました…。というのも、ファイアフライの値と、レニラの値が綺麗に相関しており、なぜレニラがこうも値がずれるのか困惑しています。具体的には、あるウェルでのレニラは259に対し、別のウェルでのレニラは6255でした。 私の何かが間違っているのでしょうか？ ライシスバッファーはプロメガ基質キットに付属の5xのものを使用しています。水で5倍に希釈しています。 不思議なことに、この1xでは細胞が溶けておらず、そのため自己判断で1％トリトンX100を加えています。コントロールとしてGFPを用いることは問題でしょうか？どこから質問をしてよいのか、混乱しています。すみません。ただ、常識的に考えれば、レニラで補正した値が正しい実験結果だとは思うのですが、、。ご意見お寄せいただけrますと幸いに存じます。

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