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返信ありがとうございます。 削除/引用 No.6360-10 - 2017/10/10 (火) 08:31:23 - 外科医 臨床でバタバタしている間にたくさんの返信をありがとうございます。 固定、透過処理を行いトライしてみます。 たくさんのご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6360-9 - 2017/10/07 (土) 10:33:12 - X ゲノムDNA抽出だけが目的であれば、固定細胞でもできますから、固定透過してアルブミンの細胞内染色をした上で、ソートすれば良いと思いますよ。 肝臓から細胞浮遊液を作った場合、肝細胞以外の細胞はどのような細胞になるのでしょう？　それによってはnegative selectionという手もあるかと思います。例えば、造血細胞や血管内皮細胞が主体であれば、CD45-CD31-TER119-の細胞群をソートする、といった感じです。胆管上皮細胞なども入ってくるのであれば、上皮系マーカーで肝細胞で発現していないものがあれば、追加すれば更によいかもしれません。 あと、肝細胞は結構大きい細胞なので、forward scatterである程度絞り込めるかもしれませんね。自分ではやった事がないので、保証はできませんが。

(無題) 削除/引用 No.6360-8 - 2017/10/05 (木) 11:23:04 - ふむふむ 私が追加で質問しようと思っていた内容が、出尽くしている・・・ さすがです 肝細胞の分離法はFACSを使わない方法もあると思いますので、もし上手くいかないようであれば、別の方法で一度トライしてみるのもありかと思います。純度は落ちてしまうかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.6360-7 - 2017/10/05 (木) 09:21:53 - lipid 疑問なんですが、 ソーティング後のFSC、SSCでの解析で、 目的の細胞であると確認されてますか？ ゲーティングしている細胞集団そのものが間違っているという、 初歩的な所のエラーは無いですよね？という意味です。 傾向だけに頼っているのではなく、 細胞の性質で正しく確認できているか、 基本的な事なので、聞くに及ばずと思うのですが。。。。

(無題) 削除/引用 No.6360-6 - 2017/10/05 (木) 01:38:16 - おお 分泌されるということは、膜表面にとどまってないということですよね、たしかに。 分泌されて溶液にある抗原と抗体（一次抗体と二次抗体）が凝縮したものを見ているのかもしれませんね。。。

アルブミン 削除/引用 No.6360-5 - 2017/10/04 (水) 21:15:42 - KIO アルブミンは細胞内で産生され分泌されるので、 細胞膜透過処理をしないと抗体では検出できないのでは？ とある論文って何でしょう？ 自分でも読んでみたいので詳しく知りたいです。 ちなみに細胞膜透過処理した細胞は、それなりのダメージを受けているはずなので、用途が限られてしまうのでは？？

(無題) 削除/引用 No.6360-4 - 2017/10/04 (水) 19:06:07 - qq ＞アルブミン抗体での染色はとある論文で肝細胞分離の証明で使用されて 固定して透過性にした肝細胞をアルブミン抗体で染色していたのではないでしょうか？ 細胞をホルムアルデヒド固定＋細胞膜を透過性処理すれば、できるかもしれませんが、ナマの肝細胞で肝細胞内の分泌前のアルブミンをFACSするのは無理でしょ？

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.6360-3 - 2017/10/04 (水) 14:58:51 - 外科医 早速の返信ありがとうございます。 ソーティングは目的細胞集団に対して7AADで死細胞除去を行っています。 細胞数カウントの際にバックグラウンドが汚い印象もあり、洗浄を繰り返し行っています。 アルブミン抗体での染色はとある論文で肝細胞分離の証明で使用されていたため、それに倣って行っています。 現時点ではゴミが多いことも考えパーコール液を使用して細胞分離を行った上でソーティングすることを現在考えております。

(無題) 削除/引用 No.6360-2 - 2017/10/04 (水) 14:34:16 - ふむふむ よくわからない現象ですね Alexa Fluor647陽性細胞の集団は本当に細胞集団なのですか？ ソーティングしたチューブ内に細胞がいないのに、再度解析すると陽性集団がいるというのは、細胞以外のものが染まっている気がします。 ゴミが非特異的に染まっている可能性はありませんか？ 死細胞染色とかで区別できるかもしれません。 あとは、ソーティング部分の機械が壊れていて、上手くソーティングできていないとかですかね？ 肝細胞のソーティングの知識は無いんですが、抗アルブミン抗体を使ってソーティングしたりフローサイトメトリーで解析するのは一般的な手法なのですか？

マウス肝細胞のソーティング 削除/引用 No.6360-1 - 2017/10/03 (火) 11:50:30 - 外科医 マウス肝細胞のソーティングを行っていますがうまくいかないので教えてください。 マウス門脈よりコラゲナーゼ潅流を行い、細胞浮遊液を作成します。 細胞数カウントを行うと生細胞の割合は70〜80％程度、採取できる細胞数はおよそ1〜2×10∧8程度です。 これをRabbit抗マウスアルブミン抗体（一次抗体）で染色し、Goat抗ウサギ抗体Alexa Fluor 647(二次抗体）で標識しています。 解析するとAlexa Fluor647陽性細胞の集団が特定でき、その後単純に抗アルブミン抗体陽性細胞をソーティングにかけています。Isotype controlも解析し、確実に陽性細胞をゲーティングしています。 しかし回収したはずのチューブ内にいつも細胞がほとんど見当たりません。ソーティング後確認として再解析を行うと細胞集団は検出されるのですが、実際に顕微鏡下で細胞カウントを行っても細胞を認めません。 ソーティングした細胞からＤＮＡ抽出をしたいと考えているのですが、細胞が分取できないためたどりつけません。 ソーティングのコツなどありましたら御教示願います。

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