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(無題) 削除/引用 No.6340-9 - 2017/09/29 (金) 09:51:46 - moz BsaI-HFやEsp3I切断部位を仕込んだPCR primerが使えれば、発現ベクターの2種の制限酵素部位に直接一方向に組み込めるよ。

(無題) 削除/引用 No.6340-8 - 2017/09/28 (木) 22:29:08 - AP >ちなみにpGEM-Tベクターなんかだと、 >EcoRIで切り出したときにSpeIがくっついてしまう側と >そうならない側がありますので、一応向きはあると言えましょうか・・・ そういう場合は、Tベクターに入れた段階で正しい向きのものを選ばないといけませんね。

(無題) 削除/引用 No.6340-7 - 2017/09/28 (木) 21:09:05 - チラ見 まずは勉強しましょう

(無題) 削除/引用 No.6340-6 - 2017/09/27 (水) 19:09:24 - AA Tベクターに入れた段階で、EcoRIともう1種別の酵素できれば、 最終産物で向きをケアする必要は無い気もしますが、 EcoRIのみでしか切れない事情などがあるのかもしれませんね。 ちなみにpGEM-Tベクターなんかだと、 EcoRIで切り出したときにSpeIがくっついてしまう側と そうならない側がありますので、一応向きはあると言えましょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.6340-5 - 2017/09/27 (水) 06:50:01 - AP Tベクターに入れたとき、何をもって逆向きというのだろう。

(無題) 削除/引用 No.6340-4 - 2017/09/27 (水) 01:00:28 - 774R 自分ならTAベクターなんか使わずに、最初からプライマーに制限酵素配列を付加して直接発現ベクターに入れるな。 ついでに、2種類の制限酵素でやれば向きも決まるし、セルフライゲーションも劇的に減る。

(無題) 削除/引用 No.6340-3 - 2017/09/27 (水) 00:15:08 - おお TAのプラスミドからマルチクローニングサイトの一部がついてくるなら、向きが違えば末端の配列が違うことになります。それが新たなベクターに入れたとき影響しなければ問題はないですけど。 どっちの向きに入っていても同じものが切り出されるなら向きは関係ありません。

(無題) 削除/引用 No.6340-2 - 2017/09/26 (火) 22:43:06 - おk オッケー！

インサートの向きの確認 削除/引用 No.6340-1 - 2017/09/26 (火) 21:06:59 - インサート ある特定の配列をPCRで増やし、それをインサートとしてTAクローニングし、プラスミドを作製しました。そのプラスミドからその特定配列を、EcoRI単独で切り出した後、同じくEcoRI処理した別の発現ベクターに組み込もうと考えているのですが、インサートの向きが順方向か逆方向かを確認する必要があるのは、TAクローニング後ではなく、最後の発現ベクターに組み込んだ後ですよね？つまり、TAクローニング後にシークエンスをチェックして、仮にインサートが逆向きに入っていても、最後の発現ベクターに組み込む段階で、順方向に入っていれば良いですよね？

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