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トランスフェクション時に多くの細胞が死ぬ トピック削除
No.6334-TOPIC - 2017/09/25 (月) 12:14:29 - a
トランスフェクションでのトラブルです。

HEK293Tに目的遺伝子にターボGFPに挿入したプラスミドをViofectinによってトランスフェクションさせています。コントロール(比較用)にターボGFPのEmpty Vector をトランスフェクションしています。コントロールはほぼ死なないのですが、目的遺伝子を挿入した方は12hでほとんど浮いて死んでしまいます。

コントロールでは死なないため、細胞やトランスフェクション試薬に問題はないとおもわれます。

プラスミドはプロメガのキットを使用して精製しています。
トランスフェクションには共に5µgしています。

よろしくお願いします。
　
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No.6334-9 - 2017/10/04 (水) 13:17:28 - a
返信遅くなって申し訳ございません。

皆様返信ありがとうございます。

とりあえず、DNAの毒性および、プロモーターを弱くして確認したいと思います。

(無題) 削除/引用
No.6334-7 - 2017/09/26 (火) 05:12:50 - おお
DNAの精製キットによるかもしれませんが、DNAに何か含まれているため毒性を示している可能性を否定するため、トランスフェクション試薬抜きで細胞にDNAを加えてみて確認したほうがいいかも。

そういう毒性があまり除けないきっとはプラスミドごとに毒性のレベルが違ったりすることもあるようですので。

毒性があるということならおそらくLPSがメインでしょうから、それを除く方法をとるべきかと。
実際にどの程度抜けるかはおいておいて、わたしは、４００mMNaClをふくむ飽和ウレアをDNA溶液と同量加えエタ沈したりすることがあります。うちはプラスミド精製ようのキットを使わないのですが、劇的に改善することがあります。

(無題) 削除/引用
No.6334-6 - 2017/09/25 (月) 17:14:16 - mon
発現量に依存して、細胞死を誘導したり、逆に生存性を向上させたりする遺伝子もあります。例えば、TNF刺激に対するNFkBみたいな。
弱いpromoterに変えてみるのも一法です。

(無題) 削除/引用
No.6334-5 - 2017/09/25 (月) 13:21:28 - a
み さん

ご返答ありがとうございます。

vectorは二つとも自分で精製しました。
機能的には癌で高発現しているものでノックダウンによりアポトーシスを引き起こしていたので、どちらかといえばanti-アポトーシスの方を予想していました。


insertありだけで毒性が出てしまう場合はあきらめた方が良いのでしょうか...

(無題) 削除/引用
No.6334-4 - 2017/09/25 (月) 12:37:57 - み
Empty vectorと問題になっているvectorが同じ人によって同様に精製されたものならinsertの機能を反映した細胞死なのかもしれないけど、細胞死を起こすことが予想されるようなinsertなのかな？

単に高発現させすぎて、毒性がinsert有の方だけで顕著に出てしまっている可能性はないのかな。

誘導系に切替えてもプロモーターの強さが同等なら12h後に死ぬよね。

(無題) 削除/引用
No.6334-3 - 2017/09/25 (月) 12:32:45 - a
あ さん

ご回答ありがとうございます。

申し訳ございませんが当方まだ培養初心者なため、誘導系に切り替えるというのをもう少し詳しく教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用
No.6334-2 - 2017/09/25 (月) 12:20:39 - あ
導入遺伝子がトキシックなんでしょうね。誘導系に切り替えましょう。

トランスフェクション時に多くの細胞が死ぬ 削除/引用
No.6334-1 - 2017/09/25 (月) 12:14:29 - a
トランスフェクションでのトラブルです。

HEK293Tに目的遺伝子にターボGFPに挿入したプラスミドをViofectinによってトランスフェクションさせています。コントロール(比較用)にターボGFPのEmpty Vector をトランスフェクションしています。コントロールはほぼ死なないのですが、目的遺伝子を挿入した方は12hでほとんど浮いて死んでしまいます。

コントロールでは死なないため、細胞やトランスフェクション試薬に問題はないとおもわれます。

プラスミドはプロメガのキットを使用して精製しています。
トランスフェクションには共に5µgしています。

よろしくお願いします。
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