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(無題) 削除/引用 No.6333-20 - 2017/10/07 (土) 17:03:33 - AP 横道ですが、 cryptic promoterって生物ゲノムのなかにもコンストラクトのなかにも結構普通にあるもんだ。 というか、in vitroで鋳型DNAとRNAポリメラーゼをまぜると特定の個所からでなく散発的に転写が起こるそうだ。効率は低いんだろうけれどね。 生物ゲノムでは特定の個所から特定の方向に向かって転写が効率的に起こるような仕組みとしてプロモーターがあるというだけで。

(無題) 削除/引用 No.6333-19 - 2017/10/07 (土) 16:40:03 - mon > Amp内の逆向きpromoterはどういう目的で働く？使う？？のでしょうか？ 目的等はありません。BKシグナルの原因の一つだったというものです。DLした論文を見つけられずすいません。1980年代のJBCかPNASだっと思います。 Luciferase assy のネガコンとしてpromoter無しのコンストラクトを使ったにもかかわらず、そこそこのシグナルがでた。 　->vector配列由来の転写開始点を調べてみたらAmp内だった。 　->目的promoterのクローン化予定部位の上流にpolyA siteを挿入したら望ましくないシグナルが著しく減少したという報告です。 もしかしたらその論文の本題は、ある遺伝子のpromoterアッセイだったかも。

(無題) 削除/引用 No.6333-18 - 2017/10/07 (土) 14:50:52 - ミリン >おおさんのプロモーター・エンハンサーの手前のポリAサイトに関する補足情報。 Amp耐性遺伝子内部に逆向きの真核生物promoter(cryptic promoter)配列があることが知られています。Luciferase assayベクターでは問題になります。 monさんの説明について質問なのですが、Amp内の逆向きpromoterはどういう目的で働く？使う？？のでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6333-17 - 2017/10/07 (土) 03:27:02 - おお monさん補足情報ありがとうございました。アンプも問題なんですね。

(無題) 削除/引用 No.6333-16 - 2017/10/07 (土) 03:25:50 - おお 実際ゲノムにもCDSの下流に複数のPolyA siteがあったりしますね。どちらを選択するかのレギュレーションがかかっていることもある（かかっていてそれが何らかの意味があるだろうという研究もありますが）ようですが。

(無題) 削除/引用 No.6333-15 - 2017/10/06 (金) 21:15:39 - mon おおさんのプロモーター・エンハンサーの手前のポリAサイトに関する補足情報。 Amp耐性遺伝子内部に逆向きの真核生物promoter(cryptic promoter)配列があることが知られています。Luciferase assayベクターでは問題になります。

(無題) 削除/引用 No.6333-14 - 2017/10/06 (金) 20:01:10 - AP SV40 3' UTRが２つはいっているとかならコンストラクトの安定性とか、関係ないところで問題が起こるかもしれないけど。 poly A+ signalとして由来の異なる3' UTRが複数入っているというだけなら問題ないと思いますよ。AATAAAの共通性くらいで干渉が起こるわけも無し。 実際のところ、発現ベクターに3' UTRを含んだcDNAをインサートとして入れることは普通にあります。インサート由来のpoly A+ signalをふくむ3' UTRとベクターに組み込まれているSV40などのそれがタンデムにならぶことになりますが、それがために上手く動かなかったという例はしりません。

(無題) 削除/引用 No.6333-13 - 2017/10/06 (金) 18:22:06 - おお >あと、BGH polyAやSC40 polyA配列がベクター内に２箇所あると良くない あること自体が良くないという理由は(変なところでストップがかかるとかないなら)ないと思います。あるcDNAの下流にタンデムに２つあるというのなら特にまずいといったことはないです。薬剤耐性マーカーがある発現ベクターでは、薬剤耐性遺伝子用のポリAサイトと、目的のものを発現させるポリAサイト２つあります。全く同じポリAならmomさんが言うように組み換えが少し気になることはありますが、使えないコンストラクトだとまではいえませんし、意外と普通に使える場合もまあまああるでしょう。 ルシフェラーゼを使ったリポーターアッセイではルシフェラーゼのあとにポリAサイトがありそこからぐるっとプラスミドを一周して、ルシフェラーゼプロモーター・エンハンサーの手前にもう一つポリAサイトがあります。 ルシフェラーゼリポーターアッセイ用のpGL４はルシフェラーゼ、薬剤耐性マーカー用のポリAサイトとプロモーター・エンハンサーの手前のポリAサイト、３つありますね。プロモーター・エンハンサーの手前のポリAサイトはマーカーのプロモーターやルシフェラーゼからの転写でポリAサイトを通り過ぎて転写されてしまいバックグランドシグナルの原因となる転写産物を低減するためのものです。 https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/bioluminescent-reporters/

(無題) 削除/引用 No.6333-12 - 2017/10/06 (金) 17:47:00 - mon > あと、BGH polyAやSC40 polyA配列がベクター内に２箇所あると良くない、といったことはあるのでしょうか？ 大腸菌内でその部位同士で相同組み換えが起きやすいと言うだけです。それが生じた場合、oriと薬剤耐性遺伝子が失われるようなら問題ないですが、そうでないとdeletion plasmidが混ざるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6333-11 - 2017/10/06 (金) 13:36:06 - ポリリン momさん、APさん 了解しました。私も当たり前のごとくで考えてなかったので勉強になります。 あと、BGH polyAやSC40 polyA配列がベクター内に２箇所あると良くない、といったことはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6333-10 - 2017/10/06 (金) 12:48:28 - mon polyA付加と転写終結は共役しているので、AATAAA配列だけではpolyA付加mRNA（成熟mRNA)が効率よく出来ず、タンパク発現も著しく低下します。

(無題) 削除/引用 No.6333-9 - 2017/10/06 (金) 12:11:38 - ポリりん APさん コメントいただきましてありがとうございます。ではSV40やBHG polyAの200bpほどの配列は入れなくても済むわけですね。これらと、AATAAAで発現量が変わったりするかわかりますか？

(無題) 削除/引用 No.6333-8 - 2017/10/06 (金) 12:01:17 - AP AATAAAです。 あくまでもポリA付加シグナルであって、転写終結シグナルではありません。 ポリA 付加シグナルよりはるか下流まで転写されてからポリA付加シグナルの10 ntほど下流で切断されてポリA ポリAポリメラーゼがポリAを付加します。 原核生物と違って真核生物には転写終結のコンセンサスは見つかっていません。一応、発現ベクターには転写終結部位が含まれていると考えられる、既知の遺伝子の3‘ UTRの配列が組み込まれています（SV40, TK, Hspなど）。

(無題) 削除/引用 No.6333-6 - 2017/10/06 (金) 11:26:19 - ポリリン APさんに質問（その他わかる方いれば回答お願いします） ポリAは AATAA だけで良いのでしょうか？ pcDNA3ではBGH polyA pGL4ではSV40 polyAがそれぞれ200bpほどでベクターに挿入されています。 たったAATAAの配列だけで転写は止まるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6333-5 - 2017/09/25 (月) 11:10:26 - ポリA APさん、おおさん 厳しいお言葉ありがとうございます。 おっしゃる通りでございます。コザックとORFを入れるだけで良いと習ったため、ポリAを自分で入れることもなかったので、何となくわかったような気でいました。 AATAA配列についても自分が使うベクター配列のMCSより下流に含まれているのか調べてみたところ確かに含まれていました。 おおさんのおっしゃられる通り、ベクターに既に含まれていて自分自身で入れる必要が無いようになっていることが今回の件から分かりました。 ありがとうございました。 非常に勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.6333-4 - 2017/09/25 (月) 05:00:27 - おお >ポリA付加配列　(poly A addition signal sequence, polyadenylation signal)　AATAAA Poly A signal（ポリAシグナル）と書かれたものもよく見ますね。

(無題) 削除/引用 No.6333-3 - 2017/09/25 (月) 04:54:41 - おお 一般の哺乳類やカエルなどの発現ベクター用のプラスミドには入っています。一般論ですので使う予定のベクターのマップ、カタログ、プロダクトマニュアルなどで一度確認してください。

(無題) 削除/引用 No.6333-2 - 2017/09/25 (月) 03:53:22 - AP ポリA付加配列　(poly A addition signal sequence, polyadenylation signal)　AATAAAですね。ポリA配列というのはpoly A tailのことを指すので不適当。 真核生物用発現ベクターでポリA付加配列がついているものにはインサートの方に入れてやる必要ありません。3' UTR込みでいれた場合、3' UTRにポリA付加配列が含まれていて。こっちが使われるということもあるでしょう。 pcDNA3.1ならtk (thymidine kinease?)遺伝子のポリA付加配列(3' UTR)が組み込まれています。使用しているベクターのしくみくらいしっかり理解した上で実験せねば。

コンストラクションでポリA配列を入れる？ 削除/引用 No.6333-1 - 2017/09/24 (日) 23:36:00 - ポリA pcDNAなどよく使われるベクターにコザックとORFを入れてクローニングすると思いますが、ポリAはこの時入れる必要はないので今までコンストラクションする際にポリAについた考えたことがありませんでした。 私の疑問は、ポリA配列とは具体的にどういう配列を言うのでしょうか？ 一般的なベクターにはポリAは入っているから、自分自身で入れる必要は無いのでしょうか？

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