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(無題) 削除/引用 No.6328-15 - 2017/09/26 (火) 18:33:38 - qq ＞本来はきちんとRNA量を（そういう試薬で）正確に測って、リファレンスGeneを探すほうがいいのでしょうが RNAを定量すると、r-RNAを圧倒的に多く含むことになる（？）ので、株間比較だとribosomeの多い少ないが大きな足かせになるのではないかなあ？ RNAよりも発現しないgenomic DNAを定量するほうが良いんじゃない？と思うのだけど、それはそれで難しいのかなあ？

(無題) 削除/引用 No.6328-14 - 2017/09/26 (火) 18:24:02 - rg >ACT1で２倍くらいの差がでてしまうのです。 >housekeeping geneなので、本来はあまり差がでないはずですよね。 株というのは同じ親株由来の別の子株ということでしょうか？ 例えば時々、哺乳動物の臓器間のHKGの発現量の違い（どのHKGがマシか）を考察している論文などがありますが、これはほぼ無意味です。 最悪18sが使えるという論文があるのでそれを引用して使いますが、この論文も批判されたり否定されている論文なのでなんとも エネルギー消費の多い肝臓とそれ以外の細胞のGapdh（解糖系のHKG）が１細胞あたり同じ発現量だと思いますか？ 細胞形態も大きさも違う細胞のActb（細胞骨格のHKG）が１細胞あたり同じ発現量だと推定する根拠はありますか？ 「株」が何を意味しているのかよく分かりませんでしたが、違うものの間をHKGで補正しようという考えは間違えですし、昔の教科書にはそう書いてありますよね。最近は端折られていますが 自分の実験系において何が適切な補正か考えを持っておいた方がいいと思います。 本来はきちんとRNA量を（そういう試薬で）正確に測って、リファレンスGeneを探すほうがいいのでしょうが まぁ、実際のところ、適当に有名なのを複数測ってqBase+などで、統計上確かそうなGeneを選択すればいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6328-13 - 2017/09/24 (日) 12:37:49 - み 株の違いによるバラツキなのか、調製手技のバラツキなのか。 A株３サンプル、B株３サンプルなど複数調製してやってみたら良い。 RNA量をそろえてプロトコール通りやったと主張されても、だから？って言われておしまいですよ。

(無題) 削除/引用 No.6328-12 - 2017/09/24 (日) 11:19:41 - おお >ACt1で発現が低く出たものは、UBC6でも低かったです。 では考察してください。

(無題) 削除/引用 No.6328-11 - 2017/09/23 (土) 18:43:41 - JK ACt1で発現が低く出たものは、UBC6でも低かったです。

(無題) 削除/引用 No.6328-10 - 2017/09/23 (土) 14:45:28 - おお >それならばどういうhousekeeping geneを内部標準に選ぶかで結果が違ってきてしまうのではないでしょうか。 そういうことは時折あります（とくに哺乳動物の細胞を扱ってますが）。 だからACT1とUBC6で挙動が違うかとと問ったのです。

(無題) 削除/引用 No.6328-8 - 2017/09/23 (土) 13:39:37 - JK ご回答ありがとうございます。 housekeeping geneで発現量に差がでるというのはよくあることなのですね。 それならばどういうhousekeeping geneを内部標準に選ぶかで結果が違って きてしまうのではないでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6328-7 - 2017/09/23 (土) 13:24:04 - JK ＞housekeeping geneなので、本来はあまり差がでないはずですよね。 その考えは危ういと思います。もし仮にあまり差が出ないという前提が成り立つならば、手技やRTなどの性質上の問題と見るべきです。 housekeeping geneでも差がでることはあり得る、ということでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6328-6 - 2017/09/23 (土) 02:53:34 - おお >同一の株で複数回みたことはありません。 それで今回の原因を探ることができますか？ ２種のコントロールで挙動は一緒ですか？ ＞housekeeping geneなので、本来はあまり差がでないはずですよね。 その考えは危ういと思います。もし仮にあまり差が出ないという前提が成り立つならば、手技やRTなどの性質上の問題と見るべきです。

(無題) 削除/引用 No.6328-5 - 2017/09/22 (金) 22:48:16 - JK ACT1で２倍くらいの差がでてしまうのです。 housekeeping geneなので、本来はあまり差がでないはずですよね。

(無題) 削除/引用 No.6328-4 - 2017/09/22 (金) 20:47:45 - ん？ >[Re:3] JKさんは書きました : > 扱っているのはサッカロマイセス酵母です。複数の異なる株でかなり違いがでつことがあります。例えば１つの株で発現量を１とすると他方で０．５とかに > なることがしばしばあります。 2倍の差ということですか。 たった1サイクルですね。 mRNAで2倍の差が大きいとは思いませんが。

(無題) 削除/引用 No.6328-3 - 2017/09/22 (金) 20:30:45 - JK 扱っているのはサッカロマイセス酵母です。複数の異なる株でかなり違いがでつことがあります。例えば１つの株で発現量を１とすると他方で０．５とかに なることがしばしばあります。発現量が低いものは内部標準を変えても傾向はあまり変わりません。同一の株で複数回みたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.6328-2 - 2017/09/22 (金) 04:26:28 - おお それは同じ細胞からRNA精製を繰り返した場合のブレに比べるとどうですか？

リアルタイムPCRの内部標準 削除/引用 No.6328-1 - 2017/09/20 (水) 20:39:37 - JK リアルタイムPCRを行う際に、内部標準の発現量が株によってかなり ばらつくことがあります。もちろんRNA量をそろえてからcDNAを合成しており、プロトコール通りに行っています。内部標準にはACT1, UBC6を使っています。このようなものなのでしょうか。

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