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(無題) 削除/引用 No.6324-7 - 2017/09/19 (火) 12:30:18 - おお >もし、単にクローニングベクターに入れたいのだけの話なら、T-Vectorに入れる方が簡単じゃないですか？ 逆にEcoRVで切った部分ににAをTaqで導入するのも手ですよね。 PCRでバンドが見えるぐらいなら、まずLigationに使うには大過剰ありますから、２〜４ul位を４０ulぐらいの系でPfu処理したらいいかと思う。それくらいならTaqやその他の持ち込みはあまり影響しないのではないかなと。電気泳動してバンド切り出して回収していたらそういう心配はしなくてもいいかと。Pfu処理のときdNTPの添加をしておきましょう。 ただこれくらいのスケールでやるとPfu後にPCRクリーニングキットとか使いにくいかもしれない。わたしはキットはあまり使わないのでクロロフォルム、エタ沈で全量か半量をLigationにまわすかな。

(無題) 削除/引用 No.6324-6 - 2017/09/19 (火) 09:33:08 - 平滑末端 すいません、ちょっと脇道にそれるかもわかりませんが。 EcoRVサイトに入れたいとのことですが、EcoRVは平滑末端だから、どっち向きに入るかわからないですよね？その、LA Taqで増やしたものを何に入れたいと思っているのでしょうか？単にクローニングベクターに入れて増やしたいとか、そういうのとは違うのですが？ もし、単にクローニングベクターに入れたいのだけの話なら、T-Vectorに入れる方が簡単じゃないですか？pGEM-T Easyベクターとかなら買っても安いですし。 もしそんな単純な話ではないのであれば、失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.6324-5 - 2017/09/19 (火) 09:02:15 - mon 校正機能があるDNA polymeraseはendonuclease活性を有しているので、dNTPがないとDNA末端を削り込む可能性があります。 この理由によりPfu除去した方が良いです。 T4 polなら熱失活出来ます(Ligation用にbufferを変える必要もない）。 市販のキットにはendonuclease活性を阻害する抗体を添加するものもあるようですね。 成功を全く保証出来ませんが、原理的には以下の手抜き手法でも行けそう？ LA Taq産物にT4 pol酵素を加え（dNTPは残存しているので）室温で10分放置 ＞脱リン酸化ベクター+dNTP+Ligation液を加え16~22℃で保温＞形質転換

(無題) 削除/引用 No.6324-4 - 2017/09/19 (火) 06:15:50 - 初心者 monさん なるほど、確かに、Taqは除去すべきでした。ありがとうございます。 ちなみにカラム等で精製したのちにPfuを作用させた後はライゲーションにそのまま用いることはできるのでしょうか？それとも再びカラムで精製（Pfu除去）した方が良いのでしょうか？ 特には問題ないようには思えるのですが。。 質問に質問を重ねてしまいすみませんが、宜しく御願い致します。 >[Re:2] monさんは書きました : > Taqの活性が残っていると、blunting化の効率は低いと思います。 > 確実なのは、カラム等で除タンパク（電気泳動での切出しでも良い）・精製して、T4 polやPfu pol処理（どちらもdNTP必要）です。

(無題) 削除/引用 No.6324-3 - 2017/09/19 (火) 06:12:54 - mon あるいはLA Taqで増えたもの1/10量程度を鋳型にしてPfuで再増幅させるか。

(無題) 削除/引用 No.6324-2 - 2017/09/19 (火) 06:10:36 - mon Taqの活性が残っていると、blunting化の効率は低いと思います。 確実なのは、カラム等で除タンパク（電気泳動での切出しでも良い）・精製して、T4 polやPfu pol処理（どちらもdNTP必要）です。

Taqポリメラーゼの平滑化 削除/引用 No.6324-1 - 2017/09/19 (火) 05:49:22 - 初心者 いつも勉強させていただいています。 どうしても増えにくいサンプルが漸くLA　Taqで増えることがわかりました。これをなんとかEcoRVサイトにクローニングしたいのですが、プライマーに訳あって制限酵素を付加していないので、3’オーバーハングAを切り落とさなくてはなりません。この時の方法としてどのようなやり方がありますでしょうか？ 一度LA　Taqで増やしたサンプルを一つのエッペンチューブに集め、そこへPfuポリメラーゼを適量入れたのち、それを再びPCRチューブに分注して、72℃、10分ほどインキュベートすれば良いのかと考えていますが、それでいけるものなのでしょうか。 経験おありの方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけますと幸いに存じます。宜しく御願い致します。

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