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(無題) 削除/引用 No.6319-20 - 2017/09/18 (月) 09:04:02 - X 例えば、遺伝子Aの通常型をEx1-Ex2a、お調べになっているスプライスバリアントをEx1-Ex2b、と仮に表記するとします。トピ主さんの140bpのプロダクトの配列は、Ex1-Ex2bである事が確認されているとの理解でよろしいでしょうか？　で、ライバルさんのフォワードプライマーは、Ex1-Ex2bのジャンクションを認識する、という事ですよね。プロダクトの長さからして、ライバルさんのプライマー配列は両方とも、トピ主さんの140bpプロダクトに含まれると考えてよろしいでしょうか？ であれば、トピ主さんの140bpプロダクトをテンプレートにして、ライバルさんのプライマーでPCRかけてみてはどうでしょうか（nested PCRみたいな感じです）。　ライバルさんのプライマーに問題があれば、この条件でもかからないと予想します。その場合、トピ主さんのフォワードとライバルさんのリバース、ライバルさんのフォワードとトピ主さんのリバース、のプライマー組み合わせで、トピ主さんの140bpプロダクトをPCRすれば、ライバルさんのプライマーのどっちに問題があるかも分かるかもしれません。 トピ主さんがNo.6319-16で書かれているように、1bpでもannealしていればPCRはかかり得るので、ライバルさんのプライマーペアは、テンプレートがなくてもプライマーダイマーの形で増幅し得る状況ですよね。その上さらにテンプレートが存在しているので、理論上はPCRがかかっても不思議はない気がします。この状況でかからないとすれば、プライマー配列の問題と思われ、トピ主さんの140bpプロダクトをテンプレート（ポジコン）として、それを示せば良いように思います。

(無題) 削除/引用 No.6319-19 - 2017/09/17 (日) 11:04:17 - プライマー おおさん >やりにくい感がわかってきました。直接的なコンフリクトを避けるためにちょっと違う実験系を使うとか（マウスだったらStrainを変えるとか、細胞だったら同じ組織由来の違う細胞株を使うとか）で同じ系で逆の結果というのを避けるというのもありえるかな。。。 ありがとございます。そうなんです。やりにくいんです。向こうはかなりのビッグラボなので…。直接的なコンフリクトを避けつつ、出来るならこちらもそれなりの雑誌に出したいのですが、むこうがこういう形で出してしまった以上、ちょっと難しいかな、と思います（研究内容から、それなりの雑誌に出した場合、どうしたってそこにレビューが回ることを考えないといけないですし。XXXさんには回さないで下さいとお願いしたがどうも無視されたようだ、という経験有り）。仰るとおり、細胞を変えるとかして、直接ぶつからない方向性も、可能性として考えておきます。 >もう一つはあなたの目標のパブリケーションの前にとりあえず発現やアイソフォームの種類のキャラクタライゼーションをマイナー雑誌に投稿しながらじわじわとエビデンスを積み上げておく。 実を言うと、140bpになるプライマーで（別細胞で）検出したというのは、既に（マイナーではないがIFはそんなに高くない）雑誌に既に出しているんですよね。こういうisoformを見つけました、機能はまだわからない、という形で。それで、向こうはそれをリファレンスに入れて今回発表しています。どう考えたものやら… >まあ堂々とプライマーセットでの比較を論文に載せて検出感度や、蛋白の発現量が見ている現象（他のラボとあなたのところで違うなら）によって閾値が違うとか、しっかりとした考察ができるようにしてもいいかもしれません。 色々な方向性がありますね。考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.6319-18 - 2017/09/17 (日) 10:07:20 - おお >相手は競合ラボで、しかも「検出可」では困るようなストーリーで論文を出しているところなので、 やりにくい感がわかってきました。直接的なコンフリクトを避けるためにちょっと違う実験系を使うとか（マウスだったらStrainを変えるとか、細胞だったら同じ組織由来の違う細胞株を使うとか）で同じ系で逆の結果というのを避けるというのもありえるかな。。。 もう一つはあなたの目標のパブリケーションの前にとりあえず発現やアイソフォームの種類のキャラクタライゼーションをマイナー雑誌に投稿しながらじわじわとエビデンスを積み上げておく。 まあ堂々とプライマーセットでの比較を論文に載せて検出感度や、蛋白の発現量が見ている現象（他のラボとあなたのところで違うなら）によって閾値が違うとか、しっかりとした考察ができるようにしてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6319-17 - 2017/09/17 (日) 09:54:45 - プライマー みさん >WBで分子量の区別がつかないという理解で良いですか？ はい。その通りです。両者は1KDa違わず、それでいてサイズは100KDa越えなので、 WBでは区別出来ませんでした。 >mRNAで区別できる部分があるのなら、UTRなど、その部分に対するRNA干渉で蛋白レベルが減少することを証明するのは？ isoform特異的なRNA干渉ということですね。アイデアありがとうございます。ちょっと考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.6319-16 - 2017/09/17 (日) 09:48:43 - プライマー qIHC?さん >Primer自体がEx間に乗るように設計されてないから、SYBRではあんまり好まれない（避けられる）設計だなって思ったので Ex間に乗るようなプライマーデザインを推奨する教科書があるのは知っているのですが、自分はそれには懐疑的です。というのは、自分はAlternative Splicing Variantを研究対象にしていて、 遺伝子X: Ex1-Ex2-Ex3 遺伝子X': Ex1-Ex3 のような形で、それぞれの遺伝子にspecificなプライマーデザインということで、遺伝子XにspecificなForwardプライマーをEx2-3間に、遺伝子X'にspecificなForwardプライマーをEx1-3間にデザインしたことがあります。最初のデザインでは、20bpの長さのプライマーで、8bpが後ろ側のExに乗る形でした。結果、どちらのプライマーも、どちらのisoformも検出しました（もちろん、型があっていなければ発現量がだいぶ低く見積もられる形ではありますが）。また、gDNAをテンプレートにした場合も、Reverse PrimerがEx3に位置していた場合は同様でした。 プライマーの3'側末端が（大げさに言えば）1bpでもannealしていればPCRはかかることになるので（これも異論あるとは思いますが）、Fwd、Rev両プライマーを同じExon上にデザインするのは、たとえプライマーの一部だけであっても、gDNAの混入（私の実験系だと、別isoformも）があった場合に逆にノイズを拾いやすくするだけのように思います。RevプライマーをEx4以降におけば良いかもしれませんが、サイズ的制約（増幅効率の為にプロダクトサイズを短く抑える）からそれは好ましくない場合が多いですし。 もちろん、プライマーのエキソン間にまたがっている部分の比を変えることで問題を防げる場合もあるとは思います。私は上述の8bpを短くしていって、5bpまで短くしたら上述のnon-specific問題は解決しました。しかし、そのプライマーは増幅効率が悪くて使用がためらわれるものでした。 こういう問題に3回遭遇したことがあります。 gDNAのイントロン部分も含め、遺伝子の配列によってこういう問題が起こったり起こらなかったりすると思いますが、自分としては、両プライマーが同一エキソン上にあるようなデザインにするよりは、完全に別なエキソン上に置くデザインの方が好ましいと思っています。もちろん、イントロンが短くてgDNAからの増幅が考えられるかどうかとか考慮してデザインは変えますが。 >別にProbe設計しなくてもゲノムDNAで増えないことをWetで示してればいいと思います すいません。これもちょっと意味が取れなかったです。逆にお聞きしますが、Probeでやった場合にはgDNAで増えないかチェックしないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6319-15 - 2017/09/17 (日) 08:38:42 - み > みさんもおおさんも仰るとおり、WBでのタンパク発現を示すのは良いアイデアだと思います。ただ、詳細はちょっと書けないのですが、この遺伝子Aは別遺伝子のAlternative Splicing Variantでして、両者を区別できる抗体というのが少なくとも現在は存在しない為、話がややこしくなってしまっています。 WBで分子量の区別がつかないという理解で良いですか？ mRNAで区別できる部分があるのなら、UTRなど、その部分に対するRNA干渉で蛋白レベルが減少することを証明するのは？

(無題) 削除/引用 No.6319-14 - 2017/09/17 (日) 08:27:23 - プライマー おおさん 確かに、自分のプライマーがポジコンと捉えることも出来ますね。先にTK-1さんへの返信で書いたように、相手は競合ラボで、しかも「検出可」では困るようなストーリーで論文を出しているところなので、自分のプライマーを送ることはちょっと難しいです。 >それぐらい短いアンプリコンで実験した経験や、そういう論文を見たことある人からコメントがあればいいですけど。。。 私もそれを期待していますが、教科書的には100-150bp位でデザインすることとあると思うので、なかなか経験者はいないかもしれないですね。 みさん >westernで蛋白発現を示して根底から崩したら良い。 序にcoding全長領域をcloningしてシーケンスで確認しておいてやれば良い。 みさんもおおさんも仰るとおり、WBでのタンパク発現を示すのは良いアイデアだと思います。ただ、詳細はちょっと書けないのですが、この遺伝子Aは別遺伝子のAlternative Splicing Variantでして、両者を区別できる抗体というのが少なくとも現在は存在しない為、話がややこしくなってしまっています。それで、今はin situなんかで両mRNAの発現を区別できないものかどうか考えているのですが、経験が無くて手が遅くなっているところです。

(無題) 削除/引用 No.6319-13 - 2017/09/17 (日) 08:14:28 - プライマー 皆様、コメントありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6319-12 - 2017/09/16 (土) 12:04:07 - おお たしかにWBしてみるのはいいかもね。

(無題) 削除/引用 No.6319-11 - 2017/09/16 (土) 11:01:49 - み >[Re:8] プライマーさんは書きました : > 仰るとおり、別ラボのプライマーでは検出できないだけという可能性も考えています。実は、研究対象の細胞で遺伝子Aがそこそこ発現しているとなると、別ラボのストーリーは根底から崩れてしまうのです。 westernで蛋白発現を示して根底から崩したら良い。 序にcoding全長領域をcloningしてシーケンスで確認しておいてやれば良い。

(無題) 削除/引用 No.6319-10 - 2017/09/16 (土) 10:56:44 - qIHC? 短い方はProbeでやれないからSYBRなんだろうけど 140bpの方ってIntron挟んでるものの、Primer自体がEx間に乗るように設計されてないから、SYBRではあんまり好まれない（避けられる）設計だなって思ったので 別にProbe設計しなくてもゲノムDNAで増えないことをWetで示してればいいと思います 別ラボがそのPrimerSetだけで、遺伝子Aが低発現であることを確認して実験進めてるとも思えないですし

(無題) 削除/引用 No.6319-9 - 2017/09/16 (土) 10:49:54 - おお あなたの系（１４０ぐらいの長さのやつ）で検出できていて、それを用いてその短いやつが検出できないわけだから、ポジコンで検出できないという風に捉えることもできるんじゃないでしょうか。逆にあなたが使っているプライマーセットをそのラボに送って比較してもらったらどうでしょう。 個人的には４０ぐらいの長さで末端がオーバーラップしたようなプライマーを使っているのは見たことがありません。一般的には短くて９０弱ぐらいまでじゃないですかね。理論的には不可能と言えませんので、そのプライマーセットはワークしてないか、検出感度がかなり低いと考えてもいいのかもしれません。１４０とかのプライマーセットをデザインしてもだめなときはだめだし。 それぐらい短いアンプリコンで実験した経験や、そういう論文を見たことある人からコメントがあればいいですけど。。。

(無題) 削除/引用 No.6319-8 - 2017/09/16 (土) 08:59:44 - プライマー TK-1さん 実は、別ラボというのはライバル（視しているのはこっちだけだが）ラボでして、共同研究しているラボとかではないので、ポジコンがあるのかどうか、そもそもプライマーがワークするかどうかチェックしたのか、わからない状態です。 仰るとおり、別ラボのプライマーでは検出できないだけという可能性も考えています。実は、研究対象の細胞で遺伝子Aがそこそこ発現しているとなると、別ラボのストーリーは根底から崩れてしまうのです。

(無題) 削除/引用 No.6319-6 - 2017/09/16 (土) 08:16:42 - TK-1 別のラボのプライマーのポジコンってあるんですか？ただ単に別のラボのプライマーでは検出できないだけじゃないんですか？

(無題) 削除/引用 No.6319-5 - 2017/09/16 (土) 01:53:53 - プライマー qIHC?さん > >ReverseプライマーはEx2の5'側にあり、サイズが39bp（両プライマーの最3’末端の位置が共通）。 > ってまさか > > F：−−→ > R：　　← > > 　　　　↑両プライマーの最3’末端の位置が共通 > ってこと？ F：−−−−−−−−−→ R：　　　　　　　　　←−−−−−−−−− というかんじです。重なりが1bp。それぞれプライマーの長さが20bp。 今読み返したら、「サイズ」の書き方が悪かったです。サイズ、はプロダクトサイズの意味で書いていました。訂正すると、私のはプライマーの長さが両方20bpで、PCRプロダクト（Amplicon）サイズが140bpになります。別ラボのプライマーも、プライマーの長さは両方20bpで、PCRプロダクトサイズが39bpになります。 >ついでに140bpの方もSYBRであってTaqmanでEx1-2あたりのProbe確認してないなら「遺伝子Aの発現が認められた」という結論自体が？ すいません、ここの意味がよくわかりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6319-2 - 2017/09/16 (土) 01:11:25 - qIHC? え？ >ReverseプライマーはEx2の5'側にあり、サイズが39bp（両プライマーの最3’末端の位置が共通）。 ってまさか F：−−→ R：　　← 　　　　↑両プライマーの最3’末端の位置が共通 ってこと？ だとすると、何したいか分かんない ついでに140bpの方もSYBRであってTaqmanでEx1-2あたりのProbe確認してないなら「遺伝子Aの発現が認められた」という結論自体が？

極端に短いPCR productを作るプライマー 削除/引用 No.6319-1 - 2017/09/16 (土) 00:32:45 - プライマー qPCRのプライマーデザインについて質問です。 とある遺伝子Aの発現量を調べるためにqPCRを行っているのですが 私のプライマーはEx1とEx2それぞれの中央付近に位置し、サイズが140bp。ある細胞で遺伝子Aの発現がそこそこ強くみられるという結果を得られます。事情があってシークエンスにかけたことがあり、産物が間違いなくPCRで出来たものであることは確認済みです。 別ラボのプライマーはForwardプライマーがEx1とEx2にかかっていて（Ex1に15bp、Ex2に5bp）、ReverseプライマーはEx2の5'側にあり、サイズが39bp（両プライマーの最3’末端の位置が共通）。ある細胞で遺伝子Aの発現はほとんど検出できない、という結果。 試しに別ラボと同じデザインのプライマーを注文してやってみたところ、確かにこのプライマーでは遺伝子Aの発現はほとんど検出できませんでした。 極端に短いプロダクトを作る、最3'末端が重なっているようなプライマーというのは、何が問題なのでしょうか？理屈の上では、PCRがかかって発現をきちんと検出できてもおかしくはないと思うのですが。ご存知の方、おられましたら教えて下さい。よろしくお願いします。

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