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(無題) 削除/引用 No.6315-7 - 2017/09/16 (土) 09:40:40 - mon 目的が合えば、薬剤耐性遺伝子のpromoterを省いて、挿入遺伝子のpromoterを利用する手もあります。 また相同組み換え領域を100-300bpと短くすると良いかもしれません。 大腸菌DH10B株でしたが、目的遺伝子を含む大きな領域をduplicateしていて（後でなにかの記事のようなもので知った）２種の薬剤耐性遺伝子(KOを２回）を使う必要があるなと考えたこともあります。 もしかすると1アレルはKOできているかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.6315-5 - 2017/09/15 (金) 18:17:51 - att やり方に問題はないと思いますが、カナマイシン耐性の形質がもともとあるなら、効率の面で厳しいのじゃないかと思います。 クロラムフェニコール（CatGC）とかテトラサイクリンとかマイナーですが、耐性が少ないと思われる抗生物質カセットを探すのが、早いかと思います。 どうしても抗生物質がないなら、LacZとか細菌でも使えるカラーセレクションカセットも加えるでも、行けると思います。 もう一つは、もし対象の細菌の複製起点配列がわかっているなら、それをもとのPlasmidに複製配列加えて、環状のままトランスフォーム、１週間抗生物質添加で培養（相同組み換え待つ）、１週間抗生物質抜いて培養（Plamid抜く）、PlateingしてコロニーPCRにすると、取れにくい細菌でも行けると思います。

(無題) 削除/引用 No.6315-4 - 2017/09/15 (金) 17:16:47 - ASIA >中年さん 回答ありがとうございます。 確かにバルクで回収したゲノムDNAに対してPCRを行えば、目的の株の有無の確認はできますね。早速やってみます。 私が対象としているバクテリアでは致死性についてはわからないのですが、別のバクテリアが持つ同一遺伝子をノックアウトしても致死性が無いことは確認済みですので、そこは問題ないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6315-3 - 2017/09/15 (金) 16:34:00 - 中年 含まれていることがわかれば、PCRでバンドが出ることを指標にsib selectionを繰り返せば、1/1,000,000の効率でもノックアウト株にたどり着くことができるはずです。 ところで、その遺伝子をノックアウトしてもバクテリアが死なないことは確認済みなのですよね。

(無題) 削除/引用 No.6315-2 - 2017/09/15 (金) 16:29:12 - 中年 手法については詳しい方の回答を待つとして、効率が悪いながらもノックアウトされたものが形質転換体の中に含まれているかどうかは、バルクでゲノムDNAを回収して、使った断片の外側と断片内のプライマーセットを使ってPCRをすればわかりますよね。

バクテリアにおける遺伝子ノックアウト 削除/引用 No.6315-1 - 2017/09/15 (金) 11:39:37 - ASIA グラム陰性菌バクテリアにおいて、標的遺伝子のノックアウトを試みていますが上手くいきません。 手法 ・対象とするバクテリアのゲノムから、標的遺伝子(約900 bp)部分の両端1000bp程の位置からPCRにてクローニングしノックアウト用カセットとする。これを一度プラスミドに導入しておく。 ・その後、標的遺伝子部分へカナマイシン耐性遺伝子をインサートし、カセット両端を制限酵素でカットし、標的遺伝子上流-標的遺伝子5'側−耐性遺伝子-標的遺伝子3'側-標的遺伝子下流となるDNA断片を調製する ・エレクトロセルに1000ng程のDNA断片を添加し、エレクトロポレーションを行い、約2時間の回復培養後に抗生物質入り培地にプレーティング。 ・得られたコロニーよりゲノムを抽出しPCRにてノックアウトの完了を確認。 以上の手順を踏んでいますが、何度やってもノックアウト体が取れないという状態です。 抗生物質によるスクリーニングを行っていますが、多くの抗生物質に若干の耐性があるバクテリアでして、PCRによる確認でもWTと同じ増幅パターンになってしまいます。 手法等に何か問題があるのでしょうか？それとも単純にスクリーニング効率が悪く、数を打って当たりを探すしかないのでしょうか？ 詳しい方がいましたら是非御助言を頂きたいです。 宜しくお願い致します。

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