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ありがとうございます 削除/引用 No.631-9 - 2012/06/15 (金) 03:06:39 - ねこ 立派様、 大変参考になりました。プロトコール有難うございます。これで一度トライさせて頂こうと存じます。 (゜Д゜様、 アドバイス有難うございます。SDS-PAGEで沈殿を調べてみようと存じます。

(無題) 削除/引用 No.631-8 - 2012/06/14 (木) 23:30:03 - 立派 ねこさん、 IPされるのでしたら、確かに、SDSは0.1％程度にとどめておくべきです。「Whole Cell Lysateでタンパクの検出」と書かれてたので、丸ごと電気泳動されるのかと思ってました。PY抗体の場合は、種類にもよりますが、 私だったら、10�pディッシュに1mlという場合は、1% NP40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 2 mM EDTA位でしょうか。30分on ice置くよりも、加えて、かき取ってから、yellow tipで吸い出しを繰り返したり、超音波なども加えれば、速やかに可溶化されますよ。

(無題) 削除/引用 No.631-7 - 2012/06/14 (木) 22:59:50 - (゜Д゜ RIPA bufferって可溶化液としては比較的おだやかでしょ。可溶化出来ない蛋白質も結構あると思うよ。可溶化後に遠心するよね。そのときの沈殿をSDS-PAGEでチェックしてみるとわかるよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.631-6 - 2012/06/14 (木) 21:38:45 - ねこ お返事を頂き有難うございました。 皆様からご指摘を頂いた通り、もう一度バッファーを見直した上で、回収時の手順も見直してみようと存じます。 また立派様にひとつご質問させて頂きたいのですが、今回のLysateを利用して、あるタンパクのリン酸化チロシンの検出を試みています。IPで目的タンパクを引っ張り、ブロットで抗チロシン抗体を使用する予定です。その際に、デオキシコール酸ナトリウム1％、SDS 1％の濃度がIPでバッファーに添加する抗体に負の影響を及ぼすのではないかと心配しております。経験がないため、もしそのような高濃度でも大丈夫であったとのご経験がありましたら、ぜひご教示頂ければ大変勉強になります。宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.631-5 - 2012/06/14 (木) 21:05:53 - み 30min静置する必要がありますか？ ピペッティングで何度もdish表面にふき掛けて細胞を剥がして回収すればよい。 回収した時にはほぼtotal lysate状態になっているだろうけど、念のため10minくらいinvertするなどして抽出効率を上げるとよい。

(無題) 削除/引用 No.631-4 - 2012/06/14 (木) 20:31:58 - モモ 静置がよくないのでは・・・

(無題) 削除/引用 No.631-3 - 2012/06/14 (木) 13:15:47 - 立派 培地からのMg2+の持ち込みでEDTAの効きが落ちてるのと、DOCの濃度が低めなせいでしょう。EDTAを効かせて、DOCを1%にあげれば溶けます。ただ、単にblot用のlysate作るだけなら、0.5-1%SDSに溶かせばいいです。

(無題) 削除/引用 No.631-2 - 2012/06/14 (木) 10:31:39 - Q もう一回作り直してチェックしてみては？ バッファーの組成は調べればいくらでもあるでしょうし、 ここでどうこう話をするよりも簡単です。 それをやってみて核タンパク質が検出されないとか問題があったら そのときはまたお目にかかるかもしれませんね。

RIPAバッファーについてお教え下さい 削除/引用 No.631-1 - 2012/06/14 (木) 10:25:43 - ねこ いつも参考にさせて頂いております。 ウェスタンブロットで、RIPAバッファーを使用して回収したWhole Cell Lysateでタンパクの検出を行っていますが、ひとつ気になることがあります。バッファーの組成は50 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% SDS, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTAなのですが、10�pディッシュに1ml添加して30分氷上静置後に顕微鏡で確認したところ、核が円形の状態で確認されます。RIPAバッファーはすべてを溶解して何も見えなくなるというイメージだったのですが、バッファーの作り間違いでしょうか？ご教示を頂ければ大変ありがたく存じます。宜しくお願いします。

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