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Westernがダメなら、染色ですかね。 削除/引用 No.6309-6 - 2017/09/15 (金) 10:52:14 - DrCarter 通常はプライマーにはflox配列を含まず、flox配列の外側でプライマーを組むと思いますので、まずはPCR・電気泳動してみて、Creが効いていない長いバンドとCreでflox間が飛んだ短いバンドが確認できればよいのではないでしょうか？ ただし、組織特異的に遺伝子を飛ばしても100%飛んでいるとは限りませんし、組織内にはCreに反応しない別系統の細胞も存在していますから、Creがどの程度workしているかはわからないですね。 Westernは難しいとのことですが、必ずレビュワーには要求されると思いますし、そもそも飛んでいることが100%確認できないでその先に進んでも意味がないですので、マウスを100匹使ってでもwesternを試みた方がよいと思います。 確信がないままマウスを大量生産するのが嫌なら、組織を標的タンパク質の抗体で染色してみて、コントロールと比べてみてもよいかも知れません。

Cre-ER ,floxシステムの初動確認 削除/引用 No.6309-5 - 2017/09/14 (木) 10:27:16 - 初心 　あ様、おお様、X様回答ありがとうございます。 　flox、Creの組み込みの確認は先輩方から 　受け継いだプライマーを使用してPCRをかけています。 　一度、そのプライマーの配列を含めて今一度調べてまいります。 　タンパクで確認を行うとのアドバイスもありましたが、 　組織から取れる細胞数があまりないためそれは厳しいとなりました。 　アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6309-4 - 2017/09/14 (木) 08:09:59 - X Cre-LoxPの系が動いているか確認する前に、そのマウスにCreとfloxアレルがきちんと入ってる事を確認する必要があります。CreERをタモキシフェンで活性化して組織特異的にノックアウトするのなら、floxアレルはホモですね。この場合、flox挿入部位が分からないと、floxホモの確認が困難と思うんですが、どうしてます？　Creを活性化する前の、組み替えしてないfloxアレルを、野生型アレルから識別するのにPCRを用いているなら、そのPCR用のプライマーのうち一方は、組み替えによって欠損する配列を認識する形になっている可能性が高いので、同じプライマーでPCRすれば、組み替え効率が分かるのではないでしょうか？ もし、組み替え前のfloxアレルの確認自体ができてないのであれば、Cre-LoxPの系の確認の前に、そちらを解決すべきでしょう。マウスを供給してくれたラボに直接聞くのが早いと思います。組み換えしたアレル検出用のプライマーも一緒に聞いておくと良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6309-3 - 2017/09/14 (木) 06:23:20 - おお ちゃんと調べるのは当然のことですが、蛋白レベルでチェックするというやり方も場合によってはありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6309-2 - 2017/09/13 (水) 19:20:06 - あ フロックスマウスはあなたが作製したと言うわけではなさそうですね。ならば譲渡先にきけばわかるはず。あるいは原著を調べれば書いていないはずはないと思います。

Cre-ER、floxシステムの動作確認 削除/引用 No.6309-1 - 2017/09/13 (水) 15:38:02 - 初心 　いつも参考にさせていただいています。 　自分の研究室で 　Cre-ER,floxマウスにタモキシフェンの投与を行い、 　遺伝子を組織依存的に欠損させることになりました。 　Creシステムがうまく作動しているかの確認のために 　flox遺伝子で挟まれている塩基配列をPCRで増幅して 　確認を行うことになりました。 　しかし、使用しているマウスを使った論文を検索してみると 　どの位置にCreを組み込んだかは載せているのですが、 　floxの組み込んだ位置は記載がありませんでした。 　そこで質問なのですが、どこにfloxを組み込んだかわからない場合 　Creによる目的遺伝子の欠損が行われているかどのような 　確認方法がありますか？ 　もしくは、floxの組み込まれた位置を調べる方法があれば教えてください 　よろしくお願いします。

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