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ゲル抽出を行った後のT7E1アッセイ トピック削除
No.6299-TOPIC - 2017/09/11 (月) 11:23:27 - Koro
始めまして。
実験初心者のため、わかり辛い文章になっておりましたら申し訳ございません。

現在、CRISPR-Cas9を用いて導入した二本鎖切断の検出のために、T7 endonuclease assayを行っています。

しかし、T7 assayのためのプライマー設定がなかなかうまくいかず、ノンスペのバンドが多く見られたため、ゲル抽出を行ってからT7 assayを行いました。
すると、ゲル抽出を行っていなかったときには切断されたバンドが見られたサンプル(ポジコン)で、ゲル抽出を行うと切断されたバンドが見られなくなってしまいました。

PCR条件や新しいプライマーの設計なども行っているのですが、どうしてもバンドが一本にならず、できればゲル抽出を行いたいと思っておりましたのでとても困っています。
皆様の知恵をお貸しいただきたいです。どうぞ宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.6299-6 - 2017/09/12 (火) 17:27:06 - Koro
AAさん

ご助言ありがとうございます。
ゲル抽出を行なってから、再アニーリングを行なっています。
ゲルを溶かす時間を15〜20分程度にしているのですが、長すぎるのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.6299-5 - 2017/09/11 (月) 22:07:14 - AA
T7E1はミスマッチを含む二本鎖DNAを切断する酵素で、
このアッセイではPCR産物を、一旦変性させて再アニールすることで
鋳型DNAのheterogeneityを評価します。
PCR産物がマルチバンドだと、
「配列が部分的に一致する産物」
が混在する可能性がありますので
たしかに精製なしで評価するのは難しいと思います。

さて、ゲル抽出を挟む場合でありがちなミスとしては、
再アニーリング後にゲル抽出をしているケースですが
そちらは大丈夫でしょうか？

ゲルを溶かす条件が結構きついので
完全に相補的な組み合わせに戻ってしまうらしい、
と聞いたことがあります

(無題) 削除/引用
No.6299-4 - 2017/09/11 (月) 18:32:59 - Koro
APさん
ご助言ありがとうございます。

＞私の理解が間違っていなければ、これはDSBの検出ではなく、DSBのあとのNHEJ生じた「mutationの検出」をするのだよね。
言葉足らずでした。仰るとおりです。

ポジコンでは元々バンドが一本で切断の確認ができるのですが、目的のサンプルではノンスペが多すぎて判断がつき辛いのです･･･。
nested PCRも行ってみましたが、それでもノンスペが見られました。次の手が思いつきません･･･

(無題) 削除/引用
No.6299-3 - 2017/09/11 (月) 13:15:52 - AP
>現在、CRISPR-Cas9を用いて導入した二本鎖切断の検出のために、

私の理解が間違っていなければ、これはDSBの検出ではなく、DSBのあとのNHEJ生じた「mutationの検出」をするのだよね。

>ゲル抽出を行っていなかったときには切断されたバンドが見られたサンプル(ポジコン)で、ゲル抽出を行うと切断されたバンドが見られなくなってしまいました。

PCRでノンスペがあろうと、ゲル抽出しないときには切断、未切断が確認できるのだよね。だったらゲル抽出しなくてもいいんじゃないの？

切りだしたバンドが消化されなかったということは、切り出すバンドを間違えたか、実はノンスペバンドの消化産物を見ていたのか？

どうしても特異的なPCR産物だけを得たいというならnested PCRをしたらいいと思う。すでに複数のプライマーを試しているのだろうから、新しくプライマーを作らんでも、それらを利用出来るかもしれない。

追記です 削除/引用
No.6299-2 - 2017/09/11 (月) 13:13:44 - Koro
ゲル抽出キットはNippon geneticsとQiagenの2種類を試しました。
また、ゲルは２％TAEゲルを用いました。

ゲル抽出を行った後のT7E1アッセイ 削除/引用
No.6299-1 - 2017/09/11 (月) 11:23:27 - Koro
始めまして。
実験初心者のため、わかり辛い文章になっておりましたら申し訳ございません。

現在、CRISPR-Cas9を用いて導入した二本鎖切断の検出のために、T7 endonuclease assayを行っています。

しかし、T7 assayのためのプライマー設定がなかなかうまくいかず、ノンスペのバンドが多く見られたため、ゲル抽出を行ってからT7 assayを行いました。
すると、ゲル抽出を行っていなかったときには切断されたバンドが見られたサンプル(ポジコン)で、ゲル抽出を行うと切断されたバンドが見られなくなってしまいました。

PCR条件や新しいプライマーの設計なども行っているのですが、どうしてもバンドが一本にならず、できればゲル抽出を行いたいと思っておりましたのでとても困っています。
皆様の知恵をお貸しいただきたいです。どうぞ宜しくお願い致します。
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