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(無題) 削除/引用 No.6293-5 - 2017/09/08 (金) 19:49:43 - 素人A 大変ありがとうございます。疑問が氷解しました。

(無題) 削除/引用 No.6293-4 - 2017/09/08 (金) 17:38:30 - AP 相同組換えでtargetingを狙っても、random integrationしたものが出てくるというのは普通に起こりえます。 こういう実験て、少しでも目的のものが取れる確率が上がるように、それ以外のものが生じにくいようにと、いろいろ工夫されてきてるんですけど、やっぱり最後は確率の問題です。なるべく複数の候補を立てて、その中からいいのを選ぶってことになりますね。標的配列にDSBを起こせばそこで相同組換えが起こる確率はぐっとあがり、random integrationの起こる確率を大きく凌駕できるでしょうから、見込みのある実験です。 CRISPRがない頃は、例えばKOマウスを作るためにES細胞にドナーを入れて相同組換えを起こした細胞をスクリーニングして得るなんて操作の場合、 標的配列に対する相同組換えも、random integrationも同じくらいの頻度で起こるものでしたら、それに比べれば格段の技術の進歩。

(無題) 削除/引用 No.6293-3 - 2017/09/08 (金) 17:00:24 - 素人A お答えありがとうございます。 基本的すぎることを知らずにお恥ずかしい限りですが、勉強になります。 つまり、ゲノム編集をしてノックインをする場合でも、供与DNAが標的領域以外にも挿入される可能性があるという理解でよろしいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6293-2 - 2017/09/08 (金) 16:19:25 - AP いやー、もう教科書や実験書に普通に載っているような現象、手法なので、いまさら文献とか遡るほうが難しいんでないかい。 ランダムに挿入する現象は、おそらく二重鎖切断に対する修復機構が惹起されることで起こる、修復の誤作動のようなものだと考えるといい。 古典的なトランスジェニックマウス（卵核に供与DNAを注入する）とか、トランスフェクションした培養細胞を安定株化するというというのも、ホストの染色体に無作為の場所に偶然組み込まれる現象を利用している。この時、供与DNAがタンデムに複数連なって組み込まれるということもよく起きる。 ところであなたはノックインしたいと言っているが、knock-inとrandom integrationは相容れないよ。 knodk-inは決まった標的配列に外来遺伝子をいれこみ（targeting)、標的遺伝子を組換え改変すること。 CRISRは標的配列に二重鎖切断を起こす。二重鎖切断は組換え修復を惹起するので、切断領域と相同な配列をもつドナー配列を供与すると、内在性の配列がドナー配列にと組換えて置き換わることがあり、これによりknock-inが可能。

培養細胞でのドナーDNAのランダム挿入 削除/引用 No.6293-1 - 2017/09/08 (金) 15:48:19 - 素人A お世話になります。 マウス受精卵にプラスミドなどのDNAをインジェクションするとランダムにゲノムDNA中に挿入されるというお話を聞きました。 現在、培養細胞でゲノム編集によってノックインをしようと思っているのですが、編集せずともドナーDNAが適当な位置に挿入されたりするのでしょうか？ もし文献などもあれば教えていただきたいです。 よろしくお願いします。

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