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(無題) 削除/引用 No.6291-7 - 2017/09/10 (日) 14:37:12 - att すいません。 ＞このプラスミドは一過性に発現させると目的の遺伝子もZsGreenも発現しますので、コンストラクトには問題はありません。 とのことなので、シーケンスは不要ですね。 あとは、レンチのstable化じゃなかったですが、特定の細胞だと、挿入配列内で意図しないスプライスが起きてしまい、タンパク発現しない。というのも経験したことがあります。（正直、気づくまで時間がかかり、一番困った展開でした。） IRES-ZsGで、絶対に上流の蛋白が発現しているとは、担保されないと思います。（論文のreviewとかでは、そこ確認しろというreviewerにあったことはないですが） もし、ラボに他の種類のプロモーター違うレンチベクターがあるなら、単純に乗せ換えて、普通の細胞株に感染させてstable発現確認するが良いと思いますよ。 何なら、パッケージに使用した293を継代し直して、1週間くら待って発現確認するもありですよ。ボロボロですが、意外と増えます。 （これは、駄目という人もいると思いますが）

(無題) 削除/引用 No.6291-6 - 2017/09/10 (日) 14:14:09 - att あまりないですが、たまに起きてしまう現象かと思います。 発現タンパクの検出方法に問題ないという前提ですが、 �@一つは、仰る通り転写されても翻訳されない、分解される。 細胞の生死に影響がでるようなタンパクですと、起こることがあります。 �Aもう一つは、転写開始点がずれていて目的mRNAが全長なく下流のIRES側だけ正しく翻訳されるです。 これは、挿入するcDNAの配列に依存します。 cDNAの長さについては、短い（500bpくらい）のでも長い（2500bpくらい）のでも両方起きたことあります。 滅多にないですが、極たまに経験します。 どちらの場合も解決方法は、他の方が述べているように、 �@2Aの融合タンパクにする。 �Aベクターのプロモーターを変える。 （レンチでstable化するならEF1が細胞選びにくくメチル化も稀なので無難ですが、駄目な細胞もあります。） �Bあとは、コザック配列を長めに入れるとか、転写開始点前にスプライスアクセプターを追加で入れるというので、解決できることもあります。 です。 ただし、原因が発現するタンパク（細胞の生死に関わる）だと、解決しない可能性もありです。 まず、おすすめは2aですが、融合タンパクになることが、問題になるようなら、プロモーター変えるがおすすめです。 EF1でダメなら、メチル化懸念ありですが2番手はSFFVとかかな、CAGでも良いですが、手持ちがないとサイズ大きめなのとGCリッチ（PCRup使ってのサブクローニングは不可）でベクター作成の難易度が高いです。 でもまず最初にするのは、ベクターシーケンス（長いｃDNA ならちゃんと全長）し直して変なmutation入ってないか、ちゃんとSTOPコドンついてる確認するです。 先述されてますが、私もパッケージは第2世代の方がタイター上り易いと思います。

(無題) 削除/引用 No.6291-5 - 2017/09/08 (金) 08:04:49 - MP プロモーターは何でしょうか？CMVだと大抵弱い。経験上EFが最強でしょうか。もちろんこのあたりは細胞との相性です。IRESが上流や下流遺伝子の発現に影響を与えるのはよくあること。並列プロモーターにするとか、2A配列でつなぐ選択肢もある。それからパッケージングシステムが第三世代なのであれば、第二世代にすることで感染効率は上げられると思う。

(無題) 削除/引用 No.6291-4 - 2017/09/08 (金) 04:32:08 - おお 具体的になんのプライマリーか開示できますか？わたしはあまりそういう経験がないですが、あなたのお使いになるような細胞のトランスフェクションやウイルスベクター感染で経験がある方からコメントがつくかもしれませんので。

(無題) 削除/引用 No.6291-3 - 2017/09/08 (金) 04:03:25 - IRES おお様、ありがとうございます。 ソーティング直後に3割程度のコンタミがあることには気付いていました。なので、おそらくは発現が弱くなるようなサイレンシングは考えていませんでした。 感染効率はせいぜい数％ですし、将来的にChIP-seqを予定しているので数が必要でしてソート後に更に増やす必要があるんです。ちなみにレンチのウイルス液をCHO細胞にかけるとほぼ100％が陽性なので、ウイルス自体はきちんとできていると考えています。 >[Re:2] おおさんは書きました : > ZsGreen陽性％は70％ということは、ソーティングしたときは１００％であろうから、発現が弱くなってきてますよね。 > レンチなので十分のウイルスがあれば、感染後すぐ実験に使えばほぼ１００％が発現する状態で実験ができるのでは？感染が難しい細胞なのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.6291-2 - 2017/09/08 (金) 03:28:46 - おお ZsGreen陽性％は70％ということは、ソーティングしたときは１００％であろうから、発現が弱くなってきてますよね。 レンチなので十分のウイルスがあれば、感染後すぐ実験に使えばほぼ１００％が発現する状態で実験ができるのでは？感染が難しい細胞なのかな、、、

IRES-ZsGreenのインサートが発現していない？ 削除/引用 No.6291-1 - 2017/09/07 (木) 23:44:49 - IRES いつも勉強させていただいております。 現在、初代培養細胞にレンチウイルスベクターを感染させ、ZsGreen陽性細胞を20万個ほどソーティングしてきました。その細胞を増やしてすでに3週間ほどが経とうとしています。 ZsGreen陽性％は70％ほどを昨日確認しましたが、IRES配列の前に挿入している遺伝子（転写因子です。）のタンパク質はどうやら発現していないようです。このプラスミドは一過性に発現させると目的の遺伝子もZsGreenも発現しますので、コンストラクトには問題はありません。 一過性とウイルスによる安定発現のレベルの違いだと言われればそうなのですが、転写因子の下流の遺伝子も動いていませんでした。ZsGreenは発現しているのだから、IRES前の遺伝子も発現しているはずだと考えていますが、その考えに例外はありますでしょうか。もちろんタンパク質分解が亢進していたり、するかもしれませんが、、、。みなさまのお考えを聞かせていただけますと幸いです。

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