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低分子GTP結合タンパクのウエスタンブロットがうまくいかない トピック削除
No.6280-TOPIC - 2017/09/05 (火) 16:16:08 - しご
低分子GTP結合タンパクのひとつであるkrasのウエスタンブロットをしているのですが、バンドがすごく薄くて原因が分からず困っています。
抗体は、2種類試しましたが同様の結果でしたので手技に問題があると考えております。
低分子量の膜結合タンパクを抽出する際には何か特別な方法があるのでしょうか?
また、転写等で問題が起こっているのでしょうか？

どなたか宜しくお願い致します。
　
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No.6280-4 - 2017/09/08 (金) 05:12:08 - X
KRAS特異的な抗体（HRASやNRASとは結合しない）で、KRASだけをウエスタンで検出することが、実験目的でしょうか？　であれば、KRASが十分発現している細胞株（あるいは過剰発現細胞）をポジコンとして準備した方が無難かもしれません。最近はいい抗体が出ているのかもしれませんが、昔ちょっと苦労した記憶があります（当時はあまりいい抗体が無かったです）。細胞株によって結構発現量が違うと思います。

自分の場合、KRAS、HRAS、NRASを全部検出するpan-RAS抗体の方が使いやすかったので、もしKRAS特異抗体でなくても良いのであれば、そちらの抗体を試してみるのも手かもしれません。タンパク抽出については、サイトゾルのタンパク抽出用のバッファー（NP40バッファーなど）で十分取れます。21kDaなので、転写なども、通常の方法で十分と思います。

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No.6280-3 - 2017/09/05 (火) 19:55:46 - mon
オーバーブロッキングという現象もあります。
3%スキムミルク等を使っているなら0.3% 30分に減らすと良いです。

(無題) 削除/引用
No.6280-2 - 2017/09/05 (火) 18:50:03 - おお
低分子量とはいっても２０kDａぐらいですよね。サイズだけで考えるとそんなに難しくなるほど低いわけでもないとはおもいます。バンドが薄いからなにかWBがうまく行ってないというのも安直な感じがしますが、、、

一般的には低分子はコンディションによっては大抵のもっと大きい分子では良好でも、膜を通りぬけてしまっているという話はありますが、トランスファーのバッファーにSDSが入っていない事とかつ、メタノールが２０％ほど入っていればそんなに通り抜けてしまっているという事はないです、膜タンパクでも。ただ特定の蛋白でそういうことがある場合というのは否定はできませんけど。気になるならもしニトロセルロースを使っているならPVDFに変えてみてもいいかもしれません。

またメンブレンとの相性というのもあって、知り合いがニトロセルロースからPVDFにかえたら検出できたといった経験があると教えてくれたことがあります。PVDFをつかっているならニトロセルロースで試してみるのもやって見る価値があるかもしれません。

トランスファーだけを考えたらいいわけでもなく、SDSPAGEも最適な泳動ができるように流しているかもチェックするべきところかとも思えます。

また冒頭で書きましたが、トランスファーなどの手技の問題というよりは検出感度の問題もあるかもしれません。ならば検出感度を上げればいいので。ECLなどの検出系を高感度にするとかも選択肢かもしれませんし、単純に１次抗体の濃度を上げてバックグランドが上がらなければそれも解決策になりますし。若干バックが上がってくるけど、１次抗体のインキュベーションを４度でオーバーナイトにしてみるとか（もししてなかったら）。

蛋白抽出の仕方もマイルドにするとかフラクショネーションするとかとでライセートに含まれるあなたのターゲットの蛋白量のトータルのタンパク量に対する割合が変わってきますので、検討の余地があるかもしれません。

余談ですがK-rasは常時膜にあるわけでもなかったと思いますが、、、

上記で改善するにあたって興味があるところは、あなたの使っている試薬や条件、状況などもう少し詳細を提示して、具体的な改善策や代替え的なやり方など意見を再度聞くといいかと思います。

低分子GTP結合タンパクのウエスタンブロットがうまくいかない 削除/引用
No.6280-1 - 2017/09/05 (火) 16:16:08 - しご
低分子GTP結合タンパクのひとつであるkrasのウエスタンブロットをしているのですが、バンドがすごく薄くて原因が分からず困っています。
抗体は、2種類試しましたが同様の結果でしたので手技に問題があると考えております。
低分子量の膜結合タンパクを抽出する際には何か特別な方法があるのでしょうか?
また、転写等で問題が起こっているのでしょうか？

どなたか宜しくお願い致します。
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