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(無題) 削除/引用 No.6279-4 - 2017/09/05 (火) 15:27:14 - 田中 ＞APさん 回答ありがとうございます。 メチル化したDNAと、メチル化していないDNAをつなげ、 その物性を見る、という実験です。 プラスミドにつなぐわけではありません。 もともと欲しい配列が、 プラスミドに組み込まれており、 そこから、メチル化断片と非メチル化断片をPCRで増やしています。 「メチル化DNAを組み込んだプラスミドを大腸菌がそのまま増やしてくれたら」 というのは、PCRで、目的配列があまり増えないので、 こんなことができたらいいなという、願望でした。 説明不足ですみません。 dm5CTP置換の二重鎖の性質については初耳でした。 もう一度、プログラムを見直してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6279-3 - 2017/09/05 (火) 14:44:02 - AP 酵素の特性によってdm5CTPの基質に取る効率が違ってたりするのかなあとも思ったんですが、 問題はdm5CTPで置換された二重鎖は安定性が高く変成しにくいのでPCR反応中に鋳型となる効率が下がるからみたいっす。変性条件を上げてやるといいみたいっす。 https://academic.oup.com/nar/article/19/5/1081/1090070/PCR-with-5-methyl-dCTP-replacing-dCTP

(無題) 削除/引用 No.6279-2 - 2017/09/05 (火) 14:31:50 - AP ちなみに、どういう実験法ですか。 というのは、in vitroでメチル化したDNAをライゲーションして、それから？ 大腸菌に入れるんだとしたら、なにをする系なのかなー？　私には未知の実験手法のようなので、

全てのシトシンをメチル化したDNA断片 削除/引用 No.6279-1 - 2017/09/05 (火) 14:21:51 - 田中 トピックのものを作製しようとしています。 目的のDNA断片はプラスミドに組み込まれています。 PCRで、dNTPの代わりに、 dm5CTP、dTTP、dGTP、dATPを入れる、 というやり方で行なっていたのですが、 このやり方では、この後の操作までに十分な収量が得られず苦戦しています。 (この後、ゲル抽、ライゲーションなどを行うので、最終産物が足りないという状況です） 何か他の方法がありませんでしょうか？ メチル化DNAを組み込んだプラスミドを大腸菌がそのまま増やしてくれたら 理想的なのですが。。。 素人質問ですみません。 どうかご回答をよろしくお願い致します。

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