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(無題) 削除/引用 No.6267-4 - 2017/09/02 (土) 01:44:28 - おお 私もDTTとかMgが気になりますね。あとは塩濃度が違うと熱変性の度合いも違うでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.6267-3 - 2017/09/01 (金) 15:52:06 - AP バッファーにはマグネシウムが入ってましょ。 RNAは金属イオン存在下で加熱すると非酵素的（金属触媒依存的）に分解します。 65℃熱変性の段階では入れないほうがいいですね。

(無題) 削除/引用 No.6267-2 - 2017/09/01 (金) 15:24:02 - mon 5xバッファーを加えているので、塩濃度が上がりRNAの熱変性が不十分になった可能性があります。またMgイオンと熱でRNAの分解が生じているかも。 5xバッファー中の成分に熱に弱いものがあるかもしれません（ないと思うけど）。DTT（酵素の酸化防止剤）も熱に強くはないので有効濃度が下がり、RTの活性維持時間が短くなっているかも。

逆転写で試薬の入れる順番を間違えた影響について 削除/引用 No.6267-1 - 2017/09/01 (金) 15:02:20 - RT お世話になります。質問させてください！ mRNAをトリゾールで回収し、RTしようとしました。 正しい手順 1. RNAを水で希釈し（4 ug分）、dT primerとdNTPを加え、65度、5 minインキュベート。 2. 氷上で5 min放置 3. 5x バッファー、DDT、RT酵素を入れ、37度、90 minインキュベート。 ですが、誤ってしまい、 1. RNAを水で希釈し（4 ug分）、5x バッファー、DDTを加えてしまいました。すぐに気づき、水、dTプライマーを加え、65度、5 minインキュベート。 2. 氷上で5 min放置 3. RT酵素を入れ、37度、90 minインキュベート。 を行いました。結果、PCRは増幅しているようなのですが、実際どういった問題がありそうでしょうか？ 今再度、細胞を調整中ですが、ご意見を伺えますと幸いです。どうぞ宜しくお願いします。

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