全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6251-10 - 2017/08/30 (水) 21:36:04 - 駆け出し大学院生 細胞死はどのように確認していますか？？ 抗生剤投与してselectionをしても、接着細胞（恐らく死んでいる）が残るような細胞に出会ったことがあります。継代は全くできませんが。 CTBなどで、確認してみてはどうですか？？

(無題) 削除/引用 No.6251-9 - 2017/08/27 (日) 16:00:58 - MP 細胞がhuman neural stem cell lineというのがちょっと気になる。SP細胞みたいに薬剤の排出能が亢進しているのではなかろうか？

(無題) 削除/引用 No.6251-8 - 2017/08/27 (日) 15:58:42 - 悩む大学院生 >[Re:7] おおさん： G418を当初は200-1000で濃度をふりましたが細胞が死なず、最終的に2000まで上げました。御指摘の通り、400-600以上では培地がオレンジ色になっています。試薬は私が溶解しておりますし、おかしいなと思い何度も確認しましたので、濃度の間違いはないと思います。 念のため、Neo・Puroが効くのか確認するため他の細胞を起こしました。 仰る通り、供与して頂いた先生に改めて確認してみようと思います。細胞が違うのか、先方の勘違いでそもそもNeo.Puro耐性なのかもしれませんね。 >[Re:6] みさん: 細胞はhuman neural stem cell lineのF3という細胞です。

(無題) 削除/引用 No.6251-7 - 2017/08/27 (日) 15:23:57 - おお >G418です。2000... そんなに上げて培地が黄色くなってしまいませんか？５００ ug/mlでも加えるとかなり明るいオレンジ色になったりするので、、、だから濃度計算がおかしいとか、もらった試薬が濃度間違えて知らされてるとか、、、

(無題) 削除/引用 No.6251-6 - 2017/08/27 (日) 13:14:58 - み 細胞名は明かせないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6251-5 - 2017/08/27 (日) 12:56:47 - おお もらった細胞が何らかの原因で違うものである可能性もあるので、一度その状況を話してみてはどうでしょうか。全然関係のない細胞で実験していたというのが実験したあとで気がついても遅いし、大変な労力の無駄になりますので、

(無題) 削除/引用 No.6251-4 - 2017/08/27 (日) 10:20:20 - 悩む大学院生 >MPさん： Blasticidin, Zeocinは試していません。 所有のベクターが、Neo耐性のものとPuro耐性のものなので。 どうしてもPuro耐性が改善されない場合は、そちらも検討してみます。 >おおさん: Puroは新しいものを溶解したばかりですので、失活しているという事はないと思います。マイコの感染という可能性はあるのでしょうか？あるならチェックしてみようと思うのですが。 NeoはG418です。2000まで上げて1週間見ましたが、死にませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6251-3 - 2017/08/27 (日) 09:37:18 - MP Blasticidin, Zeocinとかは試されましたか？Zeocinは全くちがう作用機序なので感受性はあるかも。

(無題) 削除/引用 No.6251-2 - 2017/08/27 (日) 09:09:38 - おお puro １０で死なないって相当ですね。。。puroがしっかつしているか、なにかpuro耐性マーカーのベクターが入っているかも、、、 Neoは実際何を使ってますか？G４１８を使うのが普通だと思いますけど。Neoは医薬品としても使われていて哺乳類細胞にはそんなに強い作用が出ないと言われてますが、、、 また G４１８のセレクションは、死に始めるのに結構ラグタイムがあります。３日ぐらいなら細胞は結構平気に見えることもあります。

細胞株のNeo・puro耐性獲得について 削除/引用 No.6251-1 - 2017/08/27 (日) 06:50:12 - 悩む大学院生 平素こちらで勉強させて頂いております。 細胞株のNeo耐性、puro耐性の原因と安定株作成に関して質問させて下さい。 現在、human neural stem cell lineの細胞株を用いて安定発現株作成を試みています。供与頂いた先生からは、Neo、puroでselection可能と伺っておりますが、予備実験としてInfectionする前の細胞でpuroを0.25-2μg/ml加えたところ、全く死にませんでした。上限10μg/mlとしてようやく増殖抑制が見られたのですが、3日間で全てが死ぬには至りませんでした。Neoでも細胞が死なず、Neo・puroともに耐性となってしまっています。 質問１：このように、本来耐性でないはずの細胞株がNeoやpuroに耐性を獲得している場合、どのような事が考えられるのでしょうか？マイコプラズマ感染などでもあり得るのでしょうか？ 質問２：抗生剤でselectionが出来ないとしたら、GFPでソーティングと考えています。安定株作成後の導入遺伝子のSilencingを考えると、週に１回とか、継代中は定期的にソーティングでセレクションをかける必要があるのでしょうか？（他に幾つか細胞株を試しましたが、導入遺伝子がToxicでInfectionにより死んでしまいました。従って、この細胞株で株で何とか実験を進めていきたいと思っています。） 御指導のほど、宜しくお願い致します。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---