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(無題) 削除/引用 No.6249-8 - 2017/08/26 (土) 10:15:46 - qq 制限酵素部位が近すぎてdouble-digestionが上手くいかない。 ---------RE1-RE2----------------- 急がば、大廻りな方法ですが、 RE1だけで適当なstuffer-DNA（0.5-1kbpくらい）をクローンして、 ---------RE1-----------RE1-RE2--------- RE2で先に切断、一部サンプリングしてRE2切断を確認、 ---------RE1-----------RE1- 　　RE2--------- RE1で再度切断して、切り出すと、完璧でしょ？ ---------RE1 　　-----------RE1- 　　RE2-------

(無題) 削除/引用 No.6249-6 - 2017/08/26 (土) 07:30:44 - AP 使った酵素とクローニングサイトの配列またはベクターの名前を明かしてください。 消化は同時ですか順次ですか。順次消化にして切る順番を考えると解決する場合もあります。脱リン酸をすれば一方しか切れてないベクターのセルフライゲーションを防ぐことができます。でも二重消化の効率を上げないと根本的な解決にはならないですよね。

(無題) 削除/引用 No.6249-5 - 2017/08/26 (土) 07:16:19 - 774 直鎖化しただけのものと、数塩基抜けたヤツはおそらく判別不可能です。 siRNAさんと同じ状況なのかと思います。 酵素によって認識配列の外側に数塩基必要な場合があります。 なので、それぞれ１つの酵素で切れた場合の産物が、もう１つの酵素で切断できるか確認してみて下さい。 どちらも切断できる場合は、酵素が不活性かしてないか確認しましょう。 どちらかだけで切断できる場合は、順番に切断しましょう。 どちらも２つ目の酵素で切断できない場合は、あきらめましょう。 同じサイトを使って方向性は運任せでつなぐかな。（要ベクターの脱リン酸化）

(無題) 削除/引用 No.6249-4 - 2017/08/26 (土) 05:51:53 - おお ベクターを脱リン酸化するとかなりセルフは防げるけど、、、 どうしてもというなら、MCSより外の酵素と、MCS内の酵素できって長めのインサートを入れるような工夫をすると言う変則的なやり方もあり得るとはおもう。

(無題) 削除/引用 No.6249-3 - 2017/08/26 (土) 03:19:35 - siRNA siRNAベクターでトピ主さんのような状況になったことがあります。合成オリゴをアニーリングした後にベクターにライゲーションさせて作る形だったけど、 1）MCS内に制限酵素サイトが3つだけ、実際に使い物になる制限酵素サイトは二つだけだったので選択の余地無しでその二つの制限酵素サイトを使うしかないが 2）その二つは非常に近い（隣接している）ので 3）片方で切ると、もう片方の制限酵素サイトが末端に近すぎて切れなくなる（NEBのカタログで見ると、最低2又は3bpは末端から離れていないと切れないのに、0bp) というかなり駄目なデザインのベクターでした。ようあんなのコマーシャルで出したな。 「（偶然にも）両方の制限酵素で切れたベクター」だけを抽出する方法を考えましたが、私の頭では無理でした。どなたかご存知だったら教えて下さい。 私が取った解決方法は、ベクターそのものの改変でした、片方の制限酵素だけで切ったベクターに、制限酵素サイトを変える為のプロトコールで合成オリゴを入れてやって、使いたい二つの制限酵素サイト間の距離を広げてやりました。これで二つの制限酵素で簡単に切れるようになってうまくいきました。 トピ主さんがもしも同じような状況であれば、ベクターそのものの改変は有効な手だと思います。 もし、特にその二つの制限酵素サイトを使う必然性が無いのであれば、別の制限酵素サイトを使うように一からデザインを変えた方が早いかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.6249-2 - 2017/08/26 (土) 01:50:21 - ゆ 「今、プラスミド上非常に近い場所にある２つの異なる制限酵素で」とありますが、 実際の配列としようしている制限酵素を書かれるとコメントはつきやすいと思います。

２つの制限酵素による切れ方の簡単な見分け方 削除/引用 No.6249-1 - 2017/08/26 (土) 01:12:14 - Fufufu いつも勉強させてもらっています。 今、プラスミド上非常に近い場所にある２つの異なる制限酵素でそのプラスミドを切って、そこにInsertをLigationで入れるというSubCloningを行っているのですが、Self-ligationしたものばかりでうまく入ったものが取れません。ちなみに、二つのサイトの切り口は違います。 このプラスミドが２つの制限酵素で共にしっかり切断された場合、数BPだけサイズが小さくなるだけなのですが、全く切れていないものは環状で、切れているものは直鎖状だからゲル泳動すれば、切れているものだけ抽出出来ると思って泳動し切りだしましたが、結果は一緒でした。その時になって、片方だけ切れたものも直鎖となって両方切れたものとほぼ同じ位置に出てくるから、結局片方だけ切れたものが残ってSelf-ligationしているのではと気づきました。 そこで、質問なのですが、このように片方しか切れていないものと両方しっかり切れているものを簡単に見分ける方法は無いでしょうか？

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