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(無題) 削除/引用 No.6247-42 - 2017/09/13 (水) 22:19:25 - アミロイド 沢山のコメントをいただき、皆様には心から感謝しております。皆様からいただいたアドバイスを元に、実験の組み立てを行なっていきたいと思います。 ひとまず、これをもって閉じさせていただきます。皆様、どうもありがとうございました。 P.S. さらなるコメントがあったらと内心期待しておりますので、「解決」とはしないでそのままにしておきます。 アミロイド

(無題) 削除/引用 No.6247-41 - 2017/09/06 (水) 06:46:16 - アミロイド doi様 貴重な情報をありがとうございます。SDD-AGEと名梨様の案をモディファイして目的を達成できるかなと思いました。しかし、少し問題がありました。 SDD-AGEでアミロイドを泳動した場合、縦方向にタンパク質が拡散するのでそれなりの量のタンパク質が必要となると思われます。しかし、よくよく考えてみると、目的タンパク質が非常に貴重で手持ちが少なく、検出ができないかと思われます。銀染色と同等の感度のネイティブ染色でかろうじて検出できる位の濃度でしか（100 pgくらいでしょうか）使いたくはありません。手持ちが数ugしかないからです。 ウエスタンが出来ればいいのですが、検出できる抗体がないのと、仮に抗体があってもこの量だと拡散してるので検出できないのではと思います。 まず、普通に固相化してみて、下に書いたThT、抗体で検出してみて、ダメなようであれば消化する方法をやってみてもいいのかなと思いました。 しかしながらSDD-AGEという手法を知ったことはかなり良かったです。そのうち組換え品も作りたいと思っているので、その時は使えるかもしれません。貴重な情報をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6247-40 - 2017/09/05 (火) 13:58:23 - doi SDD-AGEは? https://en.wikipedia.org/wiki/SDD-AGE

(無題) 削除/引用 No.6247-39 - 2017/09/05 (火) 00:02:11 - アミロイド 名梨様 いつもコメントありがとうございます。 > ウェスタンで見るのは、通常のようにSDSで変性させて単量体にしたものです。 > アミロイド化してないものは全て分解されて、アミロイド状態のものは残ってるはずなので、検出の有無により状態を区別する手法です。 単量体化した場合、未変性か変性かアミロイドかは、同じところに泳動されると思うので判別ができなくなると思います。未消化物の有無をなにかしらの方法でしらべなければならないかと。 可溶化に拘るのはELISAで定量的に調べたいからです。当初は等量のネイティブ型およアミロイド型の抗原性を定量的に比較し、またアミロイドの伸長とともに抗原性が変化するかを調べたいと思いました。しかし、それ（等量の抗原の固相化）が困難と感じましたので、アミロイドの伸長と抗原性の関連性にしぼって調べようかと思いました。この際、名梨様にご指摘頂いたネイティブでもアミロイドでもない変性しているものの存在を考慮しなければなりません。しかし、アミロイドに反応すると結論付ける時はかなり重要ですが、反応しないとと結論付ける場合は、少なくともアミロイドが存在している場合に反応しないことを示せば良いです。 海外の報告ではアミロイドが伸長すると同時に抗原性が増すとされています。単純に固相化された抗原分子が増えるからでしょうが。 プロテアーゼ消化も良い案と思いましたが、初めはもっと単純にやって様子をみても良いかもしれません。 アミロイドが増える→ネイティブ型が減る 前者をThTで経時的にモニターし、ELISAでヒト血清の反応を調べる。ThTの蛍光が強くなるとともに、ELISAの値が下がれば、それで目的達成かと思いました。これは可溶化できているサイズのアミロイドで見てやれば良いかと。反応がないかつThTの蛍光があれば、少なくともアミロイドには反応しないとことはいえます（アミロイド以外に変性型もあるかもしれないが）。 これで名梨様がおっしゃるようにアミロイドがマイナーで差が出ないのであれば、消化の方法をして、上記の結果となるかを調べれば良いかと思います。 皆さま、特に名梨様にはかなり良い情報を頂いています。これらを考慮してもう少し案を練らないとです。また、その手の論文はよく調べてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6247-38 - 2017/09/04 (月) 17:14:04 - 名梨 >そこでアミロイドがそこまで成長しておらず、水溶性を示すアミロイドの検出 >に的を絞るのであれば、下記の方法はいかがでしょうか。 個人的には「水溶性を示すアミロイド」にそこまで拘る理由が分かりません。 目的が、件の「抗体がアミロイドに結合するかどうかの検証」ならばもっと簡単に出来ると思います。 　まあ、何が実現可能・観測可能で、何が難しくて実現困難なのか見る意味では実際にやってみるのが良いのだろうと思います。 ウェスタンで見るのは、通常のようにSDSで変性させて単量体にしたものです。 アミロイド化してないものは全て分解されて、アミロイド状態のものは残ってるはずなので、検出の有無により状態を区別する手法です。 　アミロイドの研究でどういう手法が使われているのか勉強するためにも関連の論文を良く読むことをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.6247-37 - 2017/09/02 (土) 23:28:39 - アミロイド 名梨様 GuHClはダメでしたね。アミロイドがほどけますね。アミロイド以外を確実に変性させようと思いましたが、何もせずに一次構造認識抗体で検出すべきですね。内容が複雑で頭がうまく回りません。

(無題) 削除/引用 No.6247-36 - 2017/09/02 (土) 23:17:10 - アミロイド 更に補足です。 この方法を用いればネイティブ、変性、アミロイドの3種の固相化が確認できると思います。予備検討でネイティブおよび変性状態のいずれも検出できない消化条件にしておけば良いと思います。 3種類の固相化が確認とは、ネイティブと変性タンパクはないことを確認し、アミロイドが固相化されているということです。 何度もすみません。

(無題) 削除/引用 No.6247-35 - 2017/09/02 (土) 23:05:12 - アミロイド 一部訂正です。 また、同様の条件でGuHClをウェルに添加して変性させたものに一次構造認識mAbを反応させる。 ではなく また、同様の条件で "消化後" GuHClをウェルに添加して変性させたものに一次構造認識mAbを反応させる。 でした。すみません。

(無題) 削除/引用 No.6247-34 - 2017/09/02 (土) 20:51:27 - アミロイド 名梨様 毎回アドバイスありがとうございます。プロテアーゼ消化は非常に興味深い方法です。 >まず、条件検討でnativeなものが完全に分解されアミロイド化したものが残るような、プロテアーゼ（Proteinase KやTrypsin, Chymotrypsinなど）濃度と消化時間を決める（これはWesternで）。 上記ですが、泳動した時に２量体、３量体、４量体、、、からゲルに入らないものをアミロイド型と考えるのでしょうか。現在手持ちの抗体ではアミロイドは検出できません。また、今追っているタンパク質のアミロイドに対する抗体は販売していません。凝集過程のものとアミロイドをどのように判別するかが問題です。凝集の場合はゲルに入る多量体は少ないですが、かといってアミロイドと判断することも出来ません。ゲルに入らないものはアミロイドなのか凝集したものなのか判別がつかないかと。 私のラボにある抗体は １．患者血清（おそらく立体構造認識抗体のみ） ２．一次構造認識mAb ３．立体構造認識mAb です。そこでアミロイドがそこまで成長しておらず、水溶性を示すアミロイドの検出に的を絞るのであれば、下記の方法はいかがでしょうか。 アミロイドを経時的に形成させて固相化。その際、精製タンパク質を1 ug/ml程度に限定しておき、ThTの蛍光がプラトーに達する時間を調べておく。なお、プレートはアミノプレートとする（後でGuHClを使うため）。 　↓ プラトーになる時間で固相化し、固相化アミロイドのプロテアーゼによる消化の時間の濃度を調べる（ウェル内で行うことで固相が量をモニターできる）。ThTで検出。これにより蛍光強度が大きく低下する直前の消化時間および濃度を決定。 　↓ 経時的に伸長させたアミロイドを固相化後、ウェル内で上記の条件で消化する。これに手持ちの患者血清または立体構造認識mAbを反応させる。また、同様の条件でGuHClをウェルに添加して変性させたものに一次構造認識mAbを反応させる。プレートに共有結合させているので剥がれない。 　↓ 上記のプレートをTMBを用いて、停止せずに650 nmのAbsで検出。そのプレートをそのままThTで反応させ、アミロイドを蛍光で検出。 この方法なら １．アミロイドが存在することを確認 ２．一次構造認識抗体の反応性から変性状態のものがないことを確認 ３．ネイティブ型のものがないことを確認 ４．患者血清がアミロイドを認識するかがわかる と思います。 この方法を用いればネイティブ、変性、アミロイドの3種の固相化が確認できると思います。予備検討でネイティブおよび変性状態のいずれも検出できない消化条件にしておけば良いと思います。固相化量を「未変性とアミロイドで同等にしなければならない」という必要がなく、未変性、変性タンパクがない状態でアミロイドの反応性を検討することができるかも。 名梨さんのアイデアはなかなか興味深かったので、深く考えてみました。

(無題) 削除/引用 No.6247-33 - 2017/09/01 (金) 09:07:47 - 名梨 まあ、ただこの場合の予想される問題点は、アミロイド分子中の蛋白分子が全てプレートに結合してれば問題無いものの、一部の蛋白分子だけがプレートに固定されて残りは「その分子との結合」によって固定される場合ですか。 　 其の場合は、後者の分子は変性後にはプレートに残らないかも知れず、変性前後で蛋白分子の量は違ってしまうかも知れません。 まあその辺はやってみないと分からないでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.6247-32 - 2017/09/01 (金) 09:02:34 - 名梨 一つ指摘すべきは、アミロイドは大抵は不溶性ですが、だからと言って自然に沈殿してくるわけではないと言うことです。病理学的にプラークを作ってるアミロイドなどは直ぐに沈殿するかも知れませんが、普通は「不溶性」と言うのは10万gで超遠心して落ちてくる状態を言うので、例えば細胞のLysateなどでは不溶性のアミロイドが浮遊してる状態、ある意味「懸濁」のようなものと思われます。 　件の海外のラボも、アミロイドを沈殿した後にバッファーを加え、sonicateしたりして再び其のような状態にしたものではないでしょうか。 だから、このスレの初めの方で指摘されてる通り、「溶液」中のアミロイドも他の蛋白同様にELISAプレート上に固相化することは可能と思います。ただ、アミロイドが形成される場合でも、その割合は基質全体の量に比べたらminorityであることが多いので、アミロイド化してない蛋白も同時に相当量固相化されることは予想されます。つまり、件の抗体の反応性を見ても大きな差にはならない可能性がある。 そこで、多くのアミロイドが持つ性質である「プロテアーゼ抵抗性」を利用すれば良いかも知れません。まず、条件検討でnativeなものが完全に分解されアミロイド化したものが残るような、プロテアーゼ（Proteinase KやTrypsin, Chymotrypsinなど）濃度と消化時間を決める（これはWesternで）。アミロイド形成させたサンプルとさせてないサンプルを用意し、前述の条件でプロテアーゼ処理する。プロテアーゼ阻害剤で反応を停めた後にELISAプレートに固相化し、件の抗体で反応性を見る。アミロイド化したものを塩酸グアニジンなどで変性させ、変性後の反応性も確認する。変性前後で差があれば結論が出るでしょう。 　もし定量性が欲しければ、非アミロイド化蛋白の希釈系列を作って、同様の変性処理を行い、その後の抗体への反応性を定量してアミロイド化したものの結果と比較すれば良いでしょう。 　 ThTの蛍光観察が出来るなら、固相化アミロイドで見ることも出来るかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.6247-31 - 2017/08/31 (木) 22:39:55 - アミロイド まさにその通りです、がどっちかわからない書き方をしてしまったので補足します。 >ある疾患の患者では共通してよく見られる抗体があって、その様な抗体と思われる別々の患者由来のものを論じてるのでしょうか？ がまさにその通りです。疾患は同じだが、患者は異なります。発症の仕方の違いがあるのではとにらんでいます。 分かりづらくてすみません。

(無題) 削除/引用 No.6247-30 - 2017/08/31 (木) 19:31:51 - アミロイド 名梨様 こんな方法を考えてみました。おお様のコメントで思いつきました。 まず、スペーサー付きのアミンプレートを用意する。アミロイド型抗原の固相化は少量のネイティブ型抗原をプレートに共有結合させ（例えば10 ng）。そこに吸着飽和量の抗原を入れ（例えば500 ng）、アミロイド伸長促進物質を添加後、数日間アミロイドを伸長させる。ネイティブ型抗原の固相化は飽和量（510 ng）で最初から行い、アミロイド形成阻害物質を入れておく。おそらくどちらも同mol数の固相化ができるのではと考えました。 もちろん、これをやる前にアミロイドを形成させたものを遠心などを行わずにそのまま固相化して血清の反応性とThTによる蛍光強度を調べてはみます。書き込む前にまずこれをやるべきでした。 ただ、やはりパッとしないのが海外の報告の「可溶化させた」です。

(無題) 削除/引用 No.6247-29 - 2017/08/31 (木) 19:14:47 - アミロイド いえいえ大丈夫です。 > ただ釈然としないのは、件の海外のラボでは「ヒト抗体がむしろアミロイドを認識している」と言うくだりです。この抗体は、アミロイドさんのものと同じなのでしょうか？　それとも、ある疾患の患者では共通してよく見られる抗体があって、その様な抗体と思われる別々の患者由来のものを論じてるのでしょうか？ まさにその通りです。 > もしも目的が他のラボの議論の否定であれば、同じような手法を用いた実験を行ってその再現性を取ることが最優先になると思うのですが。 同じことを考えてたのですが、「超遠心のペレット（アミロイド）を回収し、溶解して分析にかけた」との記載があるだけで、どのように溶かしたのかが書かれていません。 海外の報告ではThTでモニターしているので、アミロイド型をしたまま可溶化させているのは間違いないようです。 ところで「海外の仮説をひっくり返したい」には語弊がありました。「海外の患者と日本の患者は違う」ということを証明したいといったところでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6247-28 - 2017/08/31 (木) 16:44:58 - 名梨 なんか誤謬がありそうな文章だったので追加させて下さい 「事情が分かってきた」と言うのは、私自身が >海外の論文ではヒト抗体はアミロイドを認識しているのではという報告された >ので、それを否定したいと考えています。もしそうならば私たちの仮説がひっ >くり返ってしまうので。 と言う事情を少し理解した、と言う意味です。 ただ釈然としないのは、件の海外のラボでは「ヒト抗体がむしろアミロイドを認識している」と言うくだりです。この抗体は、アミロイドさんのものと同じなのでしょうか？　それとも、ある疾患の患者では共通してよく見られる抗体があって、その様な抗体と思われる別々の患者由来のものを論じてるのでしょうか？ もしも目的が他のラボの議論の否定であれば、同じような手法を用いた実験を行ってその再現性を取ることが最優先になると思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.6247-27 - 2017/08/31 (木) 10:10:20 - 名梨 > しかし、ネイティブ型以外で反応する可能性も考慮しなければらないですね。 事情が少しは分かってきた気がします。 ただ、考慮しなくてはいけないのは、 「『アミロイド型以外』で『反応しない』可能性」 の方です。 「抗原性が失われた」としてもそれはnative conformationが失われただけであって、random coilやmolten globuleの様な状態である可能性が高いと思います。アミロイド形成が報告された条件で抗原性が失われたとしても、アミロイド形成は蛋白がやや変性される条件で生じやすいので、その結果のみをもってアミロイド形成と言うのはやや危険な気もします。

(無題) 削除/引用 No.6247-26 - 2017/08/31 (木) 06:08:53 - アミロイド 名梨様 アミロイドについて教えてくださりありがとうございます。とても勉強になります。説明が少なかったのでヒト抗体が立体構造エピトープを認識している可能性を考えているのは下記のような結果から考えています。 X線解析から2つの立体構造をとりうるが、一方の構造をとりうる環境ではヒト血清は反応せず、他方では反応する。 解明されているエピトープは2つあり、離れた場所にある3箇所αヘリックスと一部のランダムコイルが接近した場合にエピトープとなる。他方もほぼ同じ。おそらく今回用いている血清も同じとにらんでいる。 加熱負荷依存的にヒト血清の反応性は低くなるが、分解凝集することはない。 加熱負荷依存的に抗原の疎水性が高まる。 不可逆的に機能性を失わせると、ヒト血清の反応性がなくなっていく。 加熱負荷依存的に立体構造認識マウスmAbの反応性は失われていくが、一次構造認識マウスmAbの反応性はかわらない。 加熱負荷もしくは活性が残っている一方のネイティブの立体構造をとってると思われる環境ではほとんどヒト血清の反応性かない。 そのため、立体構造認識をするヒト抗体が主で、アミロイドなどの状態を持つときはおそらくヒト抗体は反応しないのではないかと予想しています。また、論文場で目的タンパク質がアミロイドを形成しやすいとされる環境に、たまたま置いておいたら、反応性が失われました。本当にアミロイドを形成したかは調べていないので、調べる予定ではあります。 しかし、ネイティブ型以外で反応する可能性も考慮しなければらないですね。 そういう意味でも、アミロイド型はエピトープが崩れることを証明しなければならないと考えています。アミロイドが伸長とともに溶けにくくなっていくのは、分子の体積あたりの分子表面の面積比が小さくなるからでしょうか？あまり伸びていない状態で可溶性を示すならばThTでアミロイドの存在を確認しつつ、ヒト血清の反応性をまずみるべきでしょうか。ただ、溶かしたいと思ったのは、アミロイドの伸長とともにネイティブ型が少なくなっていき、ヒト血清の反応性が低下していくさまをみる必要があるのではと思ったからです。反応性がなくなっていくのはアミロイド型を認識するがが不溶化して固相化できないだけなのではという可能性を否定できないからです 海外の論文ではヒト抗体はアミロイドを認識しているのではという報告されたので、それを否定したいと考えています。もしそうならば私たちの仮説がひっくり返ってしまうので。 溶かしたいと、との質問だけだったのに込み入った話になりすみません。 なかなか難しい問題だなと感じております。

(無題) 削除/引用 No.6247-25 - 2017/08/31 (木) 01:34:10 - 名梨 件の抗体がヘリックス構造のconformatoinal epitopeを認識するとしたら話は一筋縄ではいかなそうですね。 　 あなたの仮説は、「抗原性がある＝native conformation」「抗原性がない＝アミロイド」と言う前提に依存しているように思います。 しかし実際には、あなたの話によると、「抗原性が無い＝native conformationではない」という事しか意味しない、つまりアミロイド以外のありとあらゆる変性状態を考慮する必要が出てくるわけです。 　 今では、“条件さえ揃えば”多くの蛋白がアミロイド状態になることは分かっていますが、非常にアミロイド形成効率が高い蛋白を除き、多くは形成までに長いlag timeを要するなど特殊な変性様式です。 random coilとかamorphous aggregatesと言う状態の方が確率的には生じやすいわけで、件の抗体だとそれらを区別できない可能性が高い気がしてなりません。

(無題) 削除/引用 No.6247-24 - 2017/08/29 (火) 23:08:36 - アミロイド 名梨様 論文ありがとうございます。とても勉強になりました。ただ、同じように再現するのは難しそうです。吸引型ドットブロット装置と蛍光イメージスキャナーがありません。蛍光プレートリーダーがあるので、それでやれるようにしたいと思っています。普通にピペットでブロットする手もありますが、定量解析をしたいので、バラツキが出る操作は避けたいです。ウェルに穴を開け、１つ１つアスピレーターで引き、膜を切り抜いて他のウェルに入れるなども考えましたが、プレートリーダーの仕様上サンプル80μl以上の笠がないと測定できません。また、非アミロイド型は7割型αヘリックスで構成されており、使用する抗体（血清）はαヘリックスを認識していて、反応しなくなるのは構造が壊れた時と推測しています（立体構造認識抗体）。そのため、アミロイド型となると抗体は反応性を示さなくなると予想しています。SDSで可溶化した場合、目的タンパク質が変性するかわかりませんが、変性するとすると、SDSで変性して反応しないのか、アミロイドを形成して反応しないのかが分からなくなります（ThTでアミロイドかどうかは確認できますが）。ポジティブコントロールが陽性を示さないのはマズイので、何か良い手はないかと悩み中です。

(無題) 削除/引用 No.6247-23 - 2017/08/29 (火) 19:57:25 - 名梨 それは古典的なfilter assayの短所を改善しようとした発展形のfilter assayですね。 その論文の下に表示されていたであろうTau蛋白に関する論文 ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2359897/ の方が参考になると思います。 古典的な手法は、 ttp://lindquistlab.wi.mit.edu/wp-content/uploads/2013/06/Alberti2010MethodsEnzymol.pdf の10ページ目のプロトコールににある通りですが、 いずれでも、0.1-2%SDS溶液中に蛋白を溶かして（boilするとアミロイドが壊れるのでboilせず）ドットブロットを行うのでモノマーは膜に付着せず素通りします。このSDS濃度は、アミロイドが壊れずかつモノマーが膜に付かないことが必要で条件検討する必要はあると思いますが、うまく行けばば効率良く実験できると思います。 抗体によっては、アミロイドを強く変性（antigen retrieval）しなくても結合するものも有るので、そういう抗体と件の抗体を比較すれば説得力ある結果が得られると思います。

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