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(無題) 削除/引用 No.6240-11 - 2017/08/29 (火) 02:35:48 - stranger おおさん、ありがとうございます。 候補としては、タンパク質以外にも糖鎖も考える必要がありますし、短時間の接触でも、放出されてくるようなものもあるかもしれません。しかし、現実的にはおおさんが提案されているようなビオチン化が適当のような気がします。ラベルを入れなくても、片方の細胞をラベルするだけで目的は達成できるような気がします。相互作用する物質が決まったら、改めて系を潰して検討するのがいいような気がします。候補が特異的にラベルされたりする条件が存在しませんので。

(無題) 削除/引用 No.6240-10 - 2017/08/27 (日) 22:17:03 - み 漠然としているだけでなく、説明文が上手くないので非常に分かりにくい印象です。 異種細胞間で機能する相手方のリガンドまたは接着分子を同定したいということですか？ 受容側の蛋白は分かっているのですよね？ 単純に受容側の蛋白の細胞外領域のアフィニティカラムで相手方の細胞成分をトラップして同定できないのですか？ それか受容蛋白を検出系に設定してファージの発現クローニング。古くさい方法ですけどね。 そもそもの疑問ですが、5％残存している理由が既知経路を完全に抑制できていないだけという可能性はないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6240-9 - 2017/08/27 (日) 16:05:23 - おお ちょっと詳しくはわからないですが、どうやら細胞を安定同位体を含む培地で飼うことによりMSというレベルでラベルを入れることができるようなので、そういうのを利用できないかとダメ元のアイデアを書いてみます。 まず片方の細胞の表面をビオチンでラベルします。このときタンパク質が相互作用できる程度にラベルするビオチン量とすることが重要ですが、それが評価できないので試行錯誤になるかもしれません（既知のなにか任意の相互作用するような分子で大体の探りを入れるのも手かもしれませんけど、あ酵素反応でシグナルが実際に伝達できる上限の量でラベルをすればいいか）。 で細胞はどちらの蛋白由来かわかるように異なる同位体でラベルしておく（あるいは片方だけラベルする）。 その後、細胞同士を接触させて、クロスリンクを施す（膜透過しないやつがいいかもしれません）。 細胞のLysateを作りビオチンでラベルした蛋白をストレプトアビジンビーズなどで回収。ストレプトアビジンービオチンの結合は通常の蛋白が変性するような条件でもはずれないようなので、ビオチン化した蛋白とこばれんとにクロスリンクした蛋白が回収できる。 回収したサンプルをMSにかけて、ビオチン化してない方の蛋白を同位体の種類を頼りに同定する。 この場合、相互作用した蛋白を見ているだけなので、シグナルに関与しているかどうかは、得られたリストからさくりを入れていくことになりるので、遠回りではあります。 同位体ではなく。片方をDigとか違う分子でらべる、もう一方はビオチンで細胞表面をラベルしておいて、接触させ、クロスリンク後、両者のラベルの入ったものをタンデムに精製して（Digで回収して、リリースしたあとにそれをストレプトアビジンで回収するとか）、MSに持っていくというのもありかもですね。 でその前に少し気になるのが、蛋白以外のものの相互作用でシグナルが発生している可能性です。弱いトリプシン処理とかでそういうのをかくにんできるかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.6240-8 - 2017/08/27 (日) 09:10:42 - stranger おおさんのおっしゃっていることが概ねこちらの目指していることを表していると思います。おおさんがちょっと述べられている方法も、私が最初にトピを立てさせていただいた時に述べていることと同じですし。

(無題) 削除/引用 No.6240-7 - 2017/08/26 (土) 05:34:41 - おお 表現型を酵素などで検出しているようなので、、、ちょっと具体的にはわからないですがFunctioning cloningできそうですね。

(無題) 削除/引用 No.6240-6 - 2017/08/26 (土) 05:27:53 - おお 実は興味を持ってこの質問を見ています。確かに詳細がわかればいろいろアドバイスも増えるかと思いますが、、、根っこはテクニカルにどうやってその細胞が接着してシグナルを発生させているのかという点で、細胞間でその役割を担っている分子（タンパク質だと思うが、それと決めつけていいのかという問題もあるかもしれません）を見つけたいということだと思いました。 ファンクショニングクローニングがある意味直接的なやり方のような気がしますが、そういう系がうまく作れるかというのは、実験で見ている現象を知っていないと難しいかもしれません。接触によって増えるなら、ライブラリーのトランスフェクションをして、増えてくる細胞からどの遺伝子が導入されているのか調べるという手元れるかもしれません。接触しないと死ぬと言うならもっとやりやすいかもしれません。 最近はロボットも使えたりするので、ライブラリーから一つ一つ総当たりで探すことも不可能ではないです。遺伝子Aをいれるまたは遺伝子Aのノックダウンを行った上で、シグナルが伝達されているかをなるべく簡単な系で検出するというのを９６穴とか３８４穴のプレートで数千からマン単位で総当たりすることになりますけど。 またシグナルの詳細を知っていればスクリーニングの系でもう少し分子生物学的な面白いアプローチが考案できるかもしれません。 ちょっと具体的ではないのですが、接着したあと、クロスリンクをすれば、その後MSなどでクロスリンクされたものを見つけるという手法もできなくはなさそうです。細胞でなく細胞から取ってきた膜タンパク質（膜成分）を使ってもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6240-5 - 2017/08/26 (土) 03:35:54 - stranger すでにこちらでプロジェクトの中の議論が進んでいましたので、わかったつもりになって少し省略しすぎましたね。と言っても、今回もそれほど情報がふえたわけではないのですが。すみません。 細胞は動物の血液細胞です。反応に必要な時間は数分ですが、表現系は２時間以上は続いていますが、一旦混合した細胞を分けているわけであるませんので。その表現系は、細胞外から抗体や酵素法で検出できますが、検出感度の面から酵素法を用いています。長期的に問題になるとは書きましたが、測定条件としてまず２時間前後の系でも５％程度の表現系が残っているので、まずはこの５％を検討しようと。手法が決まれば、さらに弱い系の存在かの検討は相互させる時間を伸ばすとかの方法をとりあえずはとってみようかと考えています。 副経路ですが、今はまだ、どのような経路が動いているかは調べていません。ただ、その重要性について議論が始まって、どのような作戦が取れるかについても議論が始まったところです。単一なのか、マイナーな複数の経路があるのか、そう言ったことから、どのような手法が取れるか、議論しているところです。 こちらのフォーラムでは様々な分野で活躍している方がおられるので、伺ってみようとスレを立てさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.6240-4 - 2017/08/25 (金) 12:19:26 - yuki せめて細胞の種類（動物？細菌？）、とある反応の概要、主要な経路とは何か、 接触の時間的スケール、長期的な観察のスケール、観察の際に細胞を生かす必要性の有無、主要でない経路の予想（適当でもいい）くらいは書いてくれないと何も判断が出来ない。 学生さんなのであれば、まずは実験の概要を把握している先輩か先生に聞かれることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.6240-3 - 2017/08/25 (金) 00:27:10 - stranger おっしゃる通り漠然としているのですが、知りたいことというかやりたいことが最初に書いている通り漠然としているのです。ある条件下で細胞Aと細胞Bが接触した時に、細胞Bに接着因子の起こることが知られていて、２つの細胞の間の経路Xを阻害するとその接着因子の発現が９５％以上抑制されて、残りが５％になりました。こういったときに、経路Xが主要な経路であるということには間違いありませんが、残りの５％はどうやって探すのがいいでしょうかということなのです。生体内で長期的な検討などを行う時、この５％がとっても問題になるのです。相変わらず漠然としていますが、ご意見を伺えたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.6240-2 - 2017/08/24 (木) 23:17:10 - pH 6.3 質問の内容があまりにも漠然としすぎていて、質問に答えようがないと思います。もう少し具体的なことを書かれたら、回答が集められるのではないかと思います。

相互作用分子の同定。 削除/引用 No.6240-1 - 2017/08/24 (木) 03:51:37 - stranger みなさんの知恵を拝借したいです。 ２種類の細胞が、接触するとある反応が起こることが知られています。その反応を抑えるために、すでに文献的に知られている主要な細胞表面の分子は取り除きました。そのことによって、大部分の反応は抑えられたのですが、かなりの反応が残っていることから、主要な経路以外にも相互作用する道があると考えられます。 というわけで、この残った経路をみなさんだったらどうやって捕まえますか。よろしくお願いいたします。 例えば、考えられるとしたらバイオインフォマティクスの力をかりて、経路を推定する. 一方の細胞膜成分を用いて、他方の細胞と相互作用する部位をクロスリンク、MSで同定する。 などなど。知恵をお貸しください。

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