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(無題) 削除/引用 No.623-8 - 2012/06/13 (水) 22:27:36 - どっかの姫 皆様、様々なアドバイスありがとうございます。 学会参加のため、返信が遅れました。 皆様の意見をじっくり読んで考えて、どうするべきか 検討したいです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.623-7 - 2012/06/12 (火) 19:00:16 - ~ 変性・未変性とは別に、その目的タンパク質のエピトープ部分が、細胞膜の外に立体障害がない状態で存在するかという問題もありますよね。 また、メーカーがデータを出していない条件で使用する以上は、自分でその抗体でのICCが目的タンパク質の局在（or量？）のデータが得られることを示す必要があるでしょう。 今、分かっている/考えているのは、 �@細胞膜表面に存在している目的タンパク質と当該抗体が結合できるかはメーカー情報では不明 �Aパーミアビライズをしてないので、細胞”内”のタンパク質との非特異結合はしにくいはず �B細胞膜表面に当該抗体が非特異結合するかは未評価 という状態ですよね。 >免染でもちゃんと染まったと言っても良いのでしょうか？ �@により、染まることは自分で示す必要があるでしょう。 今のデータでは、非特異結合ではないとは言えませんよね。 >ノンスペではなく比較的目的の場所に染まりやすいと考えて良いのでしょうか？ �Aで細胞"内"タンパク質との非特異結合が起きにくいは言えても、 �Bが起きないことは自分で示す必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.623-6 - 2012/06/12 (火) 17:20:11 - mAb 使用している抗体のエピトープは考慮されているでしょうか。 ＷＢ＝変性タンパク、免染＝非変性タンパクと考えると、使用されている抗体はＷＢ○、免染×の可能性が出てきます。 もちろん、免染といっても固定方法により変性するケースもあるので一概には言えません。 免染（ＦＡＣＳ等）用途の市販抗体の入手も考えるべきかと思います。 御参考までに。

Fc receptor 削除/引用 No.623-5 - 2012/06/12 (火) 14:18:33 - Hiro 当然考慮に入れているかと思われますが、扱う細胞種によってはFc receptorをある程度発現していて、IgGなどがbindすることもあります。 ですので、TSさんのコメントが重要かと.

(無題) 削除/引用 No.623-4 - 2012/06/11 (月) 12:21:17 - Q >そうなんです！細胞表面だけの発現だから、ノンスペは出にくいと考えたのですが、 TSさんがおっしゃるのと、ちょっとニュアンスが違うと思いますが（なんか理解が違う気が） あくまでも、ノンスペが出づらいという感覚は、 細胞内＋細胞表面＞細胞表面 という、染まるかもしれない場所の面積が少ないというだけであって 細胞表面だからノンスペが少ないという意味ではないです。 ふぅ、もうちょっと考えてみましょうよ・・・

(無題) 削除/引用 No.623-3 - 2012/06/11 (月) 10:24:31 - どっかの姫 TSさん！ ご回答ありがとうございます！ なるほどなるほど。コントロールIgGや発現してない細胞をコントロールに取るべきでしたね。 確かにIgGのノンスペの可能性も考えられましたね。 そうなんです！細胞表面だけの発現だから、ノンスペは出にくいと考えたのですが、細胞表面抗体を扱うのは初めてなので評価に困りました。 WBの結果も、完全なシングルバンドでははく、ノンスペのバンドもいくつか見られるし…。 だけど、パーミアビライズしてないからあまり深く考えなくてもいいのかな…。

(無題) 削除/引用 No.623-2 - 2012/06/11 (月) 09:42:57 - TS >これって、免染でもちゃんと染まったと言っても良いのでしょうか？ この抗体の説明書には免染ができると記載されてないのですが、ウエスタンは できると書いてました。 免染の場合、染まり具合だけではなく、適切なnegative controlを置いて判断する必要があります。一次抗体なし、コントロールIｇG、発現していない細胞、などなど >細胞表面を認識する抗体を使った免染は、パーミアビライズをしてないので、 ノンスペではなく比較的目的の場所に染まりやすいと考えて良いのでしょうか？ たしかにPermeabilizeしなければ、細胞内のタンパク質にクロスすることがなくなるので、確率的にノンスペが減るかもしれません。例えば、Permeabilizeすると細胞内にノンスペが出たが、しなかったら出なかった、みたいなことは起こりうるのでしょう。ただわたしは個人的には、このようなことはあまり考えませんでしたが。

細胞表面抗体について 削除/引用 No.623-1 - 2012/06/11 (月) 09:24:26 - どっかの姫 細胞表面タンパク質に対する抗体を使ってウエスタンブロットを して、目的のサイズのバンドを確認することができました。 バンドははっきり見えましたが、濃い程ではないです。 この抗体を使って免染をしたのですが、細胞全体がぼんやりとしか染まりませんでした。 これって、免染でもちゃんと染まったと言っても良いのでしょうか？ この抗体の説明書には免染ができると記載されてないのですが、ウエスタンは できると書いてました。 細胞表面を認識する抗体を使った免染は、パーミアビライズをしてないので、 ノンスペではなく比較的目的の場所に染まりやすいと考えて良いのでしょうか？

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