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N末端だけ微妙に違うisoformの発現量の比較 トピック削除
No.6229-TOPIC - 2017/08/21 (月) 17:38:55 - 遺伝子発現
表題の通りなのですが、N末端に90bp余分な配列が付いているだけで、それ以外の配列はすべて同じであるisoformの発現量を比較するにはどうすればよいのでしょうか。qPCRでは無理があるように思うのですが。。。
　
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No.6229-9 - 2017/08/22 (火) 11:00:26 - 通りすがりの経験者
>[Re:8] APさんは書きました :
> >私だったらNorthern Blotやります。Exon2か3あたりにちょうど良い制限酵素サイトあるでしょうから、それを使って
>
> 制限酵素は何のため？

あー、失礼しました。ここは忘れて下さい。

(無題) 削除/引用
No.6229-8 - 2017/08/22 (火) 10:23:54 - AP
>私だったらNorthern Blotやります。Exon2か3あたりにちょうど良い制限酵素サイトあるでしょうから、それを使って

制限酵素は何のため？

(無題) 削除/引用
No.6229-7 - 2017/08/22 (火) 09:33:23 - おお
転写開始位置などの違いで通りすがりの経験者さんが書かれているようなことをイメージしてコメント書いたつもりが、、、送れてなかった。。。

isoform 1、２が通りすがりの経験者さんの要な場合、例えばなにか処理してない細胞とした細胞からのRNAで
isoform 1/ （isoform 1＋２）を計算して比較すると、どちらのほうがisoform 1がisoform ２に比べて多いかは比較できるでしょう。ただ、計算値は実際のRNAの量としてのisoform 1/ （isoform 1＋２）ではない可能性があるので（絶対定量でなければ）、それが決めたいときは通りすがりの経験者さんおっしゃる通り結構難しいのかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.6229-6 - 2017/08/22 (火) 07:34:53 - AP
私ならS1 mapping, RNase A protection assay あるいはprimer extentionの利用を考える。

(無題) 削除/引用
No.6229-5 - 2017/08/21 (月) 23:40:40 - 通りすがりの経験者
こういうの？Exon 1が

isoform 1は
------------------------+++++++++5'

isoform 2は
------------------------5'

（うまく書き込めなかったので、N末が右側に来てしまいました）

と、isoform1がN末端に90bp余分な配列が付いていて、それ以外の配列は両isoformですべて同じ。なので、isoform 2を検出するためのプライマー（あるいはプローブ）をどこに設定しても、isoform 2だけじゃなくてisoform 1も同時に検出してしまう。

理屈上は、isoform 1特異的に検出するプライマーセット1（N末側に出ている90bp上にForward Primerを、Ex2にReverse Primer）と、両isoformを検出するプライマーセット2(Ex2とEx3とか）でqPCRを行い、その差をもってisoform 2の発現量として、プライマーセット1の結果との比較ですね。

でもこれ、実際にやってみたことがないとわからないことだと思いますが、物凄く難しいですよ。両プライマーセットの増幅効率が（発現量を比較したい細胞からのcDNAを使った場合において）完全に一致していないと、まともな結果出ませんから。

なので、私だったらNorthern Blotやります。Exon2か3あたりにちょうど良い制限酵素サイトあるでしょうから、それを使って。若い人だとNorthern Blotがわからなかったりして……。

(無題) 削除/引用
No.6229-3 - 2017/08/21 (月) 19:36:14 - AP
翻訳開始を含むエクソンがalternativeで二種類あるってことでしょうか。
それとも一種類の転写産物に二次的な開始コドンがあるんでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.6229-2 - 2017/08/21 (月) 18:05:09 - qq
＞qPCRでは無理があるように思うのですが。。。

なんで？？
いいんじゃない？

N末端だけ微妙に違うisoformの発現量の比較 削除/引用
No.6229-1 - 2017/08/21 (月) 17:38:55 - 遺伝子発現
表題の通りなのですが、N末端に90bp余分な配列が付いているだけで、それ以外の配列はすべて同じであるisoformの発現量を比較するにはどうすればよいのでしょうか。qPCRでは無理があるように思うのですが。。。
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