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(無題) 削除/引用 No.6228-7 - 2017/08/30 (水) 00:46:36 - !!!!!!! すみません。normal igGという表記は適切でなかったかもしれないです。control IgGというほうがいいですね。 normal IgGは、人為的に特定の抗原を免疫していない動物由来のIgGということで市販品がいろいろあるけど、一応、いろんな抗体のmixtureなわけで採血した動物は無菌動物でもない限り、生きている間に不顕性感染とかでいろんな菌とかに対する抗体ももってるだろうから、そういうものの中には動物の蛋白質と交差するものもあるかもしれません。なのでnormal IgGだから試料中の蛋白質とは反応しないということは必ずしも無いのでこの点は留意してください。当たり前ですがこれはロット差が大きいです。変なものと反応しないような、いいロットを探す事は大切です。 そういう意味では低分子の化学物質とか薬剤などに対して作成した精製抗体の方がcontrol IgGとしてより適していると思う。

(無題) 削除/引用 No.6228-6 - 2017/08/28 (月) 17:39:18 - TE 皆様 返答が遅れて申し訳ないと存じます。 詳細に返答をいただきありがとうございました。 サンプル量も少ないため、現在IP後のサンプルをSDS-PAGEせずにnano-LC/TOF/TOFで網羅的に解析しております。解析者から、nano-LCで分画することでバックグラウンドを落とせると伺いました。 > ！！！！！！！！！様 コンタミネーションを把握するために、コントロールを取りたいのですが、normal IgG抗体とは、どれに対するIgG抗体で行うと良いかなど、あるのでしょうか。 よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.6228-5 - 2017/08/22 (火) 13:34:48 - mon ！！！！！！！！！さん 勉強になります。有益な情報をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6228-4 - 2017/08/21 (月) 21:55:14 - ！！！！！！！！！ この種の実験は少し前までは苦労する実験でしたが、ここ３、４年のあいだに、技術的改良が進み昔と違い格段に成功しやすくなっています。以下４点を一度勉強して、実験をデザインしてみてください。 1.コントロールをとるのは必須。（normal IgG-coupled beadsを用意して、同じ細胞の同じ量のラーゼートから抗体beadsと全く同じ工程を行う。ここで検出されたものは一応コンタミナント）非特異的吸着や回収率においてビーズのメーカー間で良否がかなり大きい。すくなくとも磁気ビーズの使用を勧める 2. 安定同位体アミノ酸標識(SILAC)あるいはiTRAQ法を使う。抗体beadsのIP用とcontorolのnormal igGのIP用の細胞をそれぞれ異なる同位体標識リジン、アルギニン含有培地で培養する。細胞内蛋白質のほぼ全てが標識リジン、アルギニンで置き換わったことはあらかじめ確認する。1:4位の比率で1回継代するとよい。この方法ならばたとえ大量にコンタミナントがあっても、どれが本物のinteractantかLC-MS/MSのデータで判別できるので、抗体自体の特異性が確実ならば、純度をあまり気にしなくてもよくなる。培地をふくむキットが市販されている。 3. ゲル切り出しの方が、バックグラウンドが減るのでより正確に同定できるチャンスが増すが、ゲルからの回収率の問題などで微量なものの同定が難しくなることがある。IP物を直接調べた方が、より多くのものが同定できるとおもうが、コンタミナントが多すぎると、分析データの解析に影響するかもしれない。 4.partner分子が同定されたら、別途あらたなプレパレーションでIPしてwesternで検証する。

(無題) 削除/引用 No.6228-3 - 2017/08/21 (月) 15:35:12 - mon 以前同僚が大量の培養細胞を使って、同様の方法(IP->SDSPAGEバンド切出し、再現性を確認してからMS/MS）で調べました。再現性のあるバンドもいくつかありましたが、皮膚由来のノンスペ（ケラチン等：銀染でもバンドは見えないにもかかわらず）、非特異的結合物と判定されたものばかりでした（タンパク名が判ってから局在が異なるなど）。半年以上無駄にしたようです。 なのでMSは感度が非常に高いのでコンタミと非特異的結合には慎重に対処しましょう。依頼する予定のMSの専門家に聞いた方が良いです。非特異的結合が少ない磁気ビーズ等の情報を持っているかもしれません。 なお抗体でなくbaitとして組換えタンパクを用いた網羅的解析ではダブルタグを使った精製法でないと信頼性・再現性のある結果が得られないと記載されています。

(無題) 削除/引用 No.6228-2 - 2017/08/21 (月) 12:49:46 - おお 免疫沈降したものをそのまま分離せずかけてしまったほうが網羅的なんじゃないかな、、、PAGEで分離したらやはり数的やその他の条件（意識せずとも）で絞ってしまうことになるだろうし。PAGE後でもスケールによっては徹底的にできなくもないけど、、、労力は数に比例して大くなっていくし。

免疫沈降によるプロテオーム解析 削除/引用 No.6228-1 - 2017/08/21 (月) 12:13:44 - TE プロテオーム解析初心者です。 詳しい先生方、ご教授のほどよろしくお願いいたします。 タンパク質Aに対するポリクローナル抗体を用いて免疫沈降し、タンパク質Aと相互作用するタンパク質を網羅的に同定したいと考えております。免疫沈降法は、タンパク質Aに対するポリクローナル抗体を磁気ビーズ(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid)に直接結合させて行っております。 免疫沈降後のサンプルを用いて、LC/MS/MSにて網羅的に相互作用しているタンパク質を同定したいと考えているのですが、免疫沈降後の次のステップの実験方法について悩んでおります。すなわち、SDS-PAGEを行って分離して、バンドを一つずつ切り出して同定した方が良いのか、SDS-PAGEをせずに免疫沈降後のサンプルをそのまま用いてLC/MS/MSを行った方が良いのかを迷っております。 上記のうち、どちらの方が良いのでしょうか。SDS-PAGEを行わずにそのまま同定する方がlossが少なくて良いように思うのですが、何か短所があるのでしょうか。ご教授のほど、どうかよろしくお願い申し上げます。

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