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ゲルシフトアッセイのタンパク質ーDNAのバンドについて トピック削除
No.6226-TOPIC - 2017/08/21 (月) 04:01:16 - ここ
制御因子によるオペロンの制御機構の解析を行っているものです。
本制御因子の結合サイトがある遺伝子のプロモーター上に二つあることがわかっています。この二つの結合サイトを両方とも含むDNA断片を使ってゲルシフトアッセイを行っているのですが、タンパク質ーDNA複合体のバンドが一つだけ見られます。
しかし、他の論文では2つの制御因子結合サイトを含むDNA断片を使った場合、異なる二つのタンパク質ーDNAバンドが見られる例をよく見かけます。
この場合どのようなことが考えられるのでしょうか。電気泳動の電圧が強すぎるのでしょうか
　
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(無題) 削除/引用
No.6226-2 - 2017/08/21 (月) 07:50:30 - おお
よほど極端なことをしない限り電圧でバンドが１つになったり２つになったりは少し考えにくいような気がしますが、電圧であるとすれば泳動時のゲルの温度の問題があるかもしれません。コールドルームでやるとか、泳動そうを氷攻めにするとか、もしそうしていたら、室温でやるとかすればパターンの違いが出てくる可能性はあります。また電気泳動のバッファーが同じかどうかとか、蛋白をどのようにして得たか、オリゴDNAのクオリティー・グレード、２本鎖なら完全にアニーリングしているDNAの割合などが影響しそうなきがします。

もっと単純な理由があるとすればゲルの濃度やT/C、大きさの違いで泳動の分解能が違う可能性もあるかもしれません。

結合するだろう場所が２箇所あるということであれば、DNAと蛋白の比も影響するかもしれません。少し降ってみてもいいかもですね。

また、Cell Lysateならもっと複雑なことが起こっている可能性もあります。あなたの調べた文献おいては２つのバンドとも特異的であることを示されていますか？

ゲルシフトアッセイのタンパク質ーDNAのバンドについて 削除/引用
No.6226-1 - 2017/08/21 (月) 04:01:16 - ここ
制御因子によるオペロンの制御機構の解析を行っているものです。
本制御因子の結合サイトがある遺伝子のプロモーター上に二つあることがわかっています。この二つの結合サイトを両方とも含むDNA断片を使ってゲルシフトアッセイを行っているのですが、タンパク質ーDNA複合体のバンドが一つだけ見られます。
しかし、他の論文では2つの制御因子結合サイトを含むDNA断片を使った場合、異なる二つのタンパク質ーDNAバンドが見られる例をよく見かけます。
この場合どのようなことが考えられるのでしょうか。電気泳動の電圧が強すぎるのでしょうか
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