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(無題) 削除/引用 No.6224-11 - 2017/08/20 (日) 15:43:54 - mon Ishiguro, K., Watanabe, O., Nakamura, M., Yamamura, T., Matsushita, M., Goto, H., & Hirooka, Y. (2017). Combinational use of lipid-based reagents for efficient transfection of primary fibroblasts and hepatoblasts. BioTechniques, 63(1), 37–39. http://doi.org/10.2144/000114569

(無題) 削除/引用 No.6224-10 - 2017/08/20 (日) 14:23:54 - mon baculovirusと言う手もあるかも。 https://www.nature.com/articles/ncomms11529 細胞内小器官をGFP標識するコントロールウィルス(BacMam)というがThermoFisherから入手できるのでこれが使えるか否かの判断は容易に出来ます。

(無題) 削除/引用 No.6224-9 - 2017/08/20 (日) 13:44:24 - おお レンチなどはやれるのなら、その方向でやり始めてもいいかもしれませんね。３T３などで人とコンパチブルかどうかについてはなんとも言えませんが、かなりの実験がコンパチブルであるのは事実かと思います。 immortalized human fibroblast cell line などで探すといくらか細胞株は見つかりますが、そう言うのでTransfectionしやすい細胞があればとも思います。あるいはFibrosarcomaとかだろうか。

(無題) 削除/引用 No.6224-8 - 2017/08/20 (日) 13:09:54 - toto 同じように１％程度しか入らない細胞で、入手可能なあらゆるトランスフェクション試薬を条件も振って試しまくった（新しいのはサンプルくれますので）ことがあります。結果、最初から使ってたFugeneの系統、特にXtremeよりよいものはなかったということで、あきらめてアデノかレンチ、になってしまいました。なおXtremeでは他のと違って培地を交換しないことがポイントという事はわかりましたが。FACSでやっても、発現している1%程度の細胞が全体を代表してる保証はないし、形態的にもどうかなというものが多い印象があったので、こちらはあきらめました。 ルシフェラーゼアッセイであれば１％でも検出はできます。問題は、信頼性です。でもウイルス使っていれても、ウイルス自体が影響しないのかという問題もあるので、なかなか、解決策がありません。

(無題) 削除/引用 No.6224-7 - 2017/08/20 (日) 11:45:50 - MP あとはレポーター用の蛍光タンパク(destabilized GFPなど?)を使えばFACS で解析可能かとも思いました。導入細胞は別の蛍光タンパクで光らせれば、ゲートすることも可能かと。

(無題) 削除/引用 No.6224-6 - 2017/08/20 (日) 11:37:06 - MP うーんあとはamaxaやneonくらいしか思い浮かばないですが、数をこなすのが大変ですよね。あとはX、Yプロモーター、レポーターをall in one でlentivectorに放り込んでlentivirusで導入するとか。

(無題) 削除/引用 No.6224-5 - 2017/08/20 (日) 10:19:56 - Luc MP様、ごもっともです。 うちのラボは比較的経済的にも恵まれているのですが、PEImax, Lipofectamine2000などがありますが、どれも私の扱う細胞には毒性が強いようで、全て死んでしまいます。その中で最も良かったのがFugeneHDや6ですが、それでも1％という程度です。これだとバックグラウンドに埋もれてしまいそうですよね。。どうしたものか。 フローサイトのように、導入された細胞を螢光でゲートをかけ、その中でルシフェラーぜ活性の評価、ということであればいいんですが、そのようなものではないですもんね。

(無題) 削除/引用 No.6224-4 - 2017/08/20 (日) 10:01:22 - MP fugeneは入る細胞にはよく入るが、全く入らない細胞もあります。予算が許せば今の条件で頑張るよりも他の試薬も試すべき。

(無題) 削除/引用 No.6224-3 - 2017/08/20 (日) 08:06:33 - Luc ＞おお様、 早速コメントをいただき、ありがとうございます。 転写因子をX、ルシフェラーゼレポータに繋いだプロモータはY由来と便宜上させていただきます。 細胞は実は特殊なもので、Xに遺伝子変異を持った患者さんの皮膚由来の線維芽細胞です。 そのためこの細胞で行う必要があります。この細胞にXの安定発現細胞をどうにか作ると、Yは50倍ほど増加することが確かめられています。 一度、293Tで転写因子Xの一過性発現をさせたのですが、下流の遺伝子YはqPCRでは増加しなかったので、293Tではその制御は動いていないようです。 すべて人のものですが、最悪患者さんの細胞で行わず、別の（遺伝子導入効率の良い）線維芽細胞で行うことも考えとしてはあります。あるいはNIH3T3に導入するとマウス由来のXは人のYプロモータに作用するのでしょうか、、試してみる価値はありそうですが、どうなのでしょうか。 まずはレプリケートを取って行って見ます。ありがとうございます。 >[Re:2] おおさんは書きました : > プロモーター、エンハンサーの活性が強ければ数字は出ると思います。問題はどれほど信用できるかです。 > > 細胞は何をお使いでしょうか。おそらく研究の上でその細胞でやることに意義があるのだと思います。同じような細胞で効率が稼げるものを探すことはできませんでしょうか？また低い効率でもデーターとしての信憑性を持たせるために、比較的トランスフェクションの効率がよいよく使われるような細胞でいろいろなキャラクタライズをして、最後に興味ある細胞でも同様の（全てでなくてもKeyになる実験で）結果が得られるとしたほうがいいのかなと個人的には思います。 > > 普段から難しい細胞でやっている人もいるかと思いますから、そういう人からのコメントが付けばいいですね。

(無題) 削除/引用 No.6224-2 - 2017/08/20 (日) 07:14:06 - おお プロモーター、エンハンサーの活性が強ければ数字は出ると思います。問題はどれほど信用できるかです。 細胞は何をお使いでしょうか。おそらく研究の上でその細胞でやることに意義があるのだと思います。同じような細胞で効率が稼げるものを探すことはできませんでしょうか？また低い効率でもデーターとしての信憑性を持たせるために、比較的トランスフェクションの効率がよいよく使われるような細胞でいろいろなキャラクタライズをして、最後に興味ある細胞でも同様の（全てでなくてもKeyになる実験で）結果が得られるとしたほうがいいのかなと個人的には思います。 普段から難しい細胞でやっている人もいるかと思いますから、そういう人からのコメントが付けばいいですね。

トランスフェクションに難のある細胞でのルシフェラーゼ実験 削除/引用 No.6224-1 - 2017/08/20 (日) 05:41:44 - Luc お世話になります。一点教えていただきたいことがあり、質問させていただけませんでしょうか。 現在、ヒト接着細胞にFugeneを用いた遺伝子導入を計画しております。 ただトランスフェクション効率が非常に低く、約1％ほどです。 効率をあげる工夫と並行して、この条件でのルシフェラーゼ実験をまずは強行というか、まずはやってみようとなりました。しかし、ルシフェラーゼ実験の経験はなく、はたして1％ほどの細胞で感度よく検出できるものなのか、気になります。もしご経験のおありの方がいらっしゃいましたら、手応えのほど、いかがでしょうか？感覚だけでも教えていただけますと幸いです。

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