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脂質抽出時のタンパク定量について トピック削除
No.6217-TOPIC - 2017/08/17 (木) 13:15:12 - USA
はじめまして。細胞株から脂質を抽出して、コレステロールを定量する実験系をはじめたいと思っています。
脂質抽出はFolch法が一般的なようですが、各種論文では、コレステロール値を「タンパク質(mg）で除算する」ことでnormalizeしているようですね。細胞数で除算するという方法もあるみたいですが、前者が一般的なようです。

そこで疑問に思ったのですが、脂質抽出したサンプルで、どうやってタンパク質を定量するためのサンプルを回収したらいいのでしょうか。クロロホルムやメタノールをかけてしまうと、もうタンパク質の定量は無理なように思われるのですが。
小生の勝手な解釈では、
dishにまいた細胞をはがして回収する→この時点でタンパク定量用と脂質定量用に2等分する→タンパク定量＆脂質定量へと進める
という感じでしかできないような気がしているのですが、先輩がたはどのようにしていらっしゃるのか教えていただけますでしょうか。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.6217-6 - 2017/08/17 (木) 18:58:56 - USA
みなさまありがとうございます。
やはり、均一な細胞懸濁液（lysateではなくて）を一部タンパク定量に、その他を脂質定量に、と最初のところで配分するのが妥当ですよね。
それでやっていきます！どうもありがとうございましたmm

(無題) 削除/引用
No.6217-5 - 2017/08/17 (木) 18:46:59 - AP
細胞を水に懸濁してホモジナイズ、ソニケーションして一部をタンパク質定量、一部をそのまま（脂質抽出ぜずに）コレステロールアッセイへ。あるいは、Tx-100のような界面活性剤を少々加えるとか、ボイルのステップを入れるとかのプロトコールもあったかと。

酵素法のアッセイなんかは血液検査のため血液サンプルを特別な処理をせずに測定するために作られたようなもの。脂質の抽出なんかせず夾雑タンパク質などがあってもワークする。上記の手法は血液検査用のキットで組織などをアッセイするためのアダプテーションとして論文等に載っていた方法。

脂質抽出をするなら、タンパク質とは抽出効率がことなるのだから、標準化は脂質で行うべき。脂質膜量細胞マスを反映していると仮定してリン脂質量を測定して標準とする。

(無題) 削除/引用
No.6217-4 - 2017/08/17 (木) 17:27:30 - おお
＞脂質抽出したサンプルで、どうやってタンパク質を定量
クロロフォルム、メタノールだったらBCAならなんとかなると思うし、他の方法もコンパチブルかもしれないし、工夫すれば測れるかもしれないけど、、、

Folch法で脂質を抽出するわけですから、タンパク質は除かれると思っていいでしょう。だから、コレステロール定量用に得た溶液の中の蛋白を測定するのはあまりいい方法ではないと思います。

(無題) 削除/引用
No.6217-3 - 2017/08/17 (木) 14:34:04 - USA
ありがとうございます。そうするしかないですよね。
コレステロールはペルオキシダーゼで発色させて吸光度を測定する方法で測定します。

(無題) 削除/引用
No.6217-2 - 2017/08/17 (木) 14:01:00 - lipid
コレステロールは、ELISAで、測定するんでしょうか。

細胞を回収し、何らかの細胞溶解液にて溶解した溶液を蛋白測定し、
必要なら(再試等など）少量溶液分取後、又は全量を用いて
Folch法を進めていけばいいのではと思います。

まあ、ハーベスト細胞は均一細胞集団として、
分けて同様にそれぞれに回してもいいと思いますが。

脂質抽出時のタンパク定量について 削除/引用
No.6217-1 - 2017/08/17 (木) 13:15:12 - USA
はじめまして。細胞株から脂質を抽出して、コレステロールを定量する実験系をはじめたいと思っています。
脂質抽出はFolch法が一般的なようですが、各種論文では、コレステロール値を「タンパク質(mg）で除算する」ことでnormalizeしているようですね。細胞数で除算するという方法もあるみたいですが、前者が一般的なようです。

そこで疑問に思ったのですが、脂質抽出したサンプルで、どうやってタンパク質を定量するためのサンプルを回収したらいいのでしょうか。クロロホルムやメタノールをかけてしまうと、もうタンパク質の定量は無理なように思われるのですが。
小生の勝手な解釈では、
dishにまいた細胞をはがして回収する→この時点でタンパク定量用と脂質定量用に2等分する→タンパク定量＆脂質定量へと進める
という感じでしかできないような気がしているのですが、先輩がたはどのようにしていらっしゃるのか教えていただけますでしょうか。
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